基于形態學特征和分子數據的中國缺齒蘚科初步研究

劉永英，牛玉璐，曹　珍，趙建成*

(1 焦作高等師范專科學校 生物系，河南焦作 454001；2 河北師范大學 生命科學學院，石家莊 050024；3 衡水學院 生命科學學院， 河北衡水 053000)

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基于形態學特征和分子數據的中國缺齒蘚科初步研究

劉永英1,2，牛玉璐2,3，曹珍2，趙建成2*

(1 焦作高等師范專科學校 生物系，河南焦作 454001；2 河北師范大學 生命科學學院，石家莊 050024；3 衡水學院 生命科學學院， 河北衡水 053000)

為探討缺齒蘚類與真蘚科、提燈蘚科的系統關系，理清缺齒蘚科的系統位置和中國缺齒蘚科分類問題，該研究以中國分布的缺齒蘚科植物和相關類群4 000余份標本為材料，進行詳細的形態學研究，并選用其中35種、40份樣品的4個DNA片段(rps4、trnG、trnL-trnF 、atpB-rbcL)聯合數據用于分子系統分析，采用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)構建分子樹。結果表明：(1)在分子樹中，缺齒蘚類與真蘚科植物分別聚在具有高支持率的不同分支上，葉形、葉細胞等形態學特征也有較大差異，缺齒蘚類應從廣義的真蘚科分出。(2)在分子樹中，雖然缺齒蘚類與提燈蘚科植物聚在同一分支中，但無形態學的共源性狀，二者不應視為一個單系類群。(3)缺齒蘚科是一個自然類群，缺齒蘚科內屬間存在著密切的系統關系，缺齒蘚科的主要識別特征為：植物體小型，莖常分枝；葉形和葉細胞為絲瓜蘚型(Pohlia-like)，披針形至長橢圓形，中上部細胞狹長，線狀菱形或蠕蟲形；生殖苞多生于新生枝頂；蒴齒為互生雙齒層，常有不同程度的退化或一層蒴齒缺失，稀雙層蒴齒缺失。(4)中國缺齒蘚科包含有5屬，即缺齒蘚屬(Mielichhoferia)、絲瓜蘚屬(Pohlia)、擬絲瓜蘚屬(Pseudopohlia)、合齒蘚屬(Synthetodontium)和小葉蘚屬(Epipterygium)，目前為止共計34種(含種下分類單位)。

缺齒蘚科；真蘚科；提燈蘚科；形態性狀；分子樹；分類

缺齒蘚科(Mielichhoferiaceae)隸屬于蘚綱(Musci)，真蘚亞綱(Bryidae)，真蘚目(Bryales)。綜合現代各位學者的統計，該科共包含約6屬290種(含種下等級)[1-2]。該類群的大多數種分布于北半球，是山地、丘陵、平原及干旱荒漠蘚類群落中的重要組成成分，具有重要的生態學作用。缺齒蘚屬(Mielichhoferia)植物因常生長于含銅量高的基質上，被稱為“喜銅蘚類”；缺齒蘚屬和絲瓜蘚屬(Pohlia)的許多種喜生于酸性基質上，因此，這些植物對土壤基質的營養成分和性質具有重要的指示作用。

缺齒蘚科是苔蘚植物中的古老類群之一，分類學研究歷史較為久遠。長期以來，缺齒蘚科的系統位置和分類系統存在很大分歧(表1)。最早由Funch于1818年描述了目前包括于該屬的種Mielichhoferiamielichhoferiana，但當時被置于小石蘚屬(Weissia)[叢蘚科(Pottiaceae)]中[16]。Nees等以單層蒴齒和生于新生枝頂的生殖苞為特征建立了缺齒蘚屬(Mielichhoferia)[17]。Bruch等認為缺齒蘚屬的單層蒴齒與絲瓜蘚屬的內齒層具有同源性，因而移入真蘚科(Bryaceae)中[18]。Schimper以Mielichhoferia為模式屬建立了缺齒蘚科(Mielichhoferiaceae)，當時僅含1個屬[19]。后來的許多年中，大多數分類學家[6-8, 12-13, 20-22]追隨Brotherus[4]的觀點，堅持真蘚科是一個十分寬泛而種類繁多的類群，具有孢蒴臺部明顯、蒴齒發育完全或退化等孢子體特征和植株小型、葉披針形、葉細胞長形等配子體特征的一些類群：缺齒蘚屬、絲瓜蘚屬、小葉蘚屬(Epipterygium)、擬絲瓜蘚屬(Pseudopohlia)、合齒蘚屬(Synthetodontium)和斯克蘚屬(新擬名，Schizymenium)相繼被置于廣義真蘚科的缺齒蘚亞科(Mielichhoferioideae)、真蘚亞科(Bryoideae)或絲瓜蘚亞科(Pohlioideae)中。

近10余年來，隨著人們對廣義真蘚科分類學研究的深入，有關缺齒蘚科、真蘚科和提燈蘚科(Mniaceae)的分類學概念和系統關系出現了很多爭議。基于細胞核和葉綠體DNA序列研究結果顯示出絲瓜蘚屬、缺齒蘚屬和小葉蘚屬等類群遠離于真蘚科，而與提燈蘚科的關系更顯密切[23]。這些觀點后來也被越來越多的實驗結果所驗證[24-26]，并得到一些學者的強烈支持。于是，基于形態學和分子數據的綜合分析研究，這些新觀點被很多學者或多或少地采納并引用到現代蘚類分類系統中，如Crosby等將絲瓜蘚屬移至提燈蘚科，將缺齒蘚屬等置于缺齒蘚科[1]；Hill等[11]根據Koponen[27]關于提燈蘚科的分類學觀點，將Goffinet等[28]界定的包含有缺齒蘚屬的大科——提燈蘚科進行拆分，分出了缺齒蘚科；Frey等[14]對Goffinet等的蘚類分類系統[28]在科級以下單位做了調整，以絲瓜蘚屬、擬絲瓜蘚屬、缺齒蘚屬、合齒蘚屬和斯克蘚屬建立了缺齒蘚亞科，小葉蘚屬被置于提燈蘚亞科(Mnioideae)中。

關于中國缺齒蘚科的研究，陳邦杰[6]在《中國蘚類屬志》(上冊)中堅持了Brotherus[4]的觀點，將缺齒蘚屬中唯一的種——中華缺齒蘚(Mielichhoferiasinensis)置于真蘚科缺齒蘚亞科之中，隨后出版的中國地方苔蘚志[29-35]及中國苔蘚植物研究的重要文獻《中國苔蘚志》(第4卷)[12]和英文版(MossFloraofChina)[13]均沿用陳邦杰的蘚類分類系統[6]，將缺齒蘚類群置于真蘚科中，并記錄該類群在中國有4屬33種(含種下分類單位)。期間，絲瓜蘚屬新命名了3種：疏葉絲瓜蘚(Pohliamacrocarpa)[36]、明齒絲瓜蘚(P.hyaloperistoma)[36]和纖毛絲瓜蘚(P.hisae)[37]；最近，劉永英等命名了合齒蘚屬1新種——昆侖合齒蘚(Synthetodontiumkunlunense)，該屬是中國的首次記錄[38]。綜上所述，缺齒蘚類群在中國已記錄約有5屬34種(含種下分類單位)。汪琛穎等[39]基于核糖體DNA ITS序列的系統發育新證據分析認為，絲瓜蘚屬和缺齒蘚屬等是一個獨立于提燈蘚科之外的類群，贊同Hill等[11]建立缺齒蘚科的觀點。劉永英等[40-41]通過廣泛研究該類群標本，補充了一些地理新分布或考證了一些種的命名。《苔蘚植物，中國生物物種名錄》[15]中參照Frey等[14]蘚類植物分類系統將缺齒蘚等類群置于提燈蘚科中，最近出版的《貴州苔蘚植物志》[42]中也采用此系統。

本文旨在通過基于形態學特征和分子數據的研究，探討缺齒蘚類與真蘚科的關系及其與提燈蘚科有無共源性狀，進而確定該類群的系統位置和解決中國缺齒蘚科的分類問題，增進對該類群分類學的認識，也將對蘚類植物真蘚目的系統分類研究具有重要意義。

1　材料和方法

1.1材料

詳細研究中國分布的缺齒蘚科植物和相關類群的標本4 000余份。選用40份樣品，共35種用于分子生物學實驗，其中提燈蘚科7個樣品，絲瓜蘚屬14個樣品，短月蘚屬(Brachymenium)7個樣品，真蘚屬7個樣品，銀蘚屬(Anomobryum)、平蒴蘚屬(Plagiobryum)、大葉蘚屬(Rhodobryum)和薄囊蘚屬(Leptobryum)各1個樣品，疣壺蘚長尖變種(Gymnostomiellavernicosavar.acuminata)為外類群。材料詳細信息見表2。

表1　缺齒蘚科所含類群分類系統變更一覽表

表2　樣品信息及序列GenBank登錄號

注：*表示序列下載自GenBank，—表示數據缺失

Note：* indicates sequence download from GenBank, and — indicates absent data

1.2方法

1.2.1經典分類學研究參照國內外相關文獻[2, 6-13, 29-37]，利用解剖鏡、顯微鏡和掃描電子顯微鏡等對中國分布的缺齒蘚科植物和相關類群4000余份標本的形態特征進行詳細研究。憑證標本存放于河北師范大學植物標本館(HBNU)。

1.2.2DNA提取和PCR擴增在解剖鏡下挑選樣品，漂洗清除附著在樣品上的雜質，自然風干后使用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)按照說明書提取總DNA。PCR擴增采用25 μL體系(總DNA 20 ng，dNTP 200 mmol·L-1，10×plus bufferTaq2.5 μL，primer各0.5 μmol·L-1，MgCl21 mmol·L-1，Taqpolymerase 0.1 unit)，引物信息見表3。

各片段擴增反應程序的初始步驟均為95 ℃預變性7 min，最后72 ℃延伸5 min。中間35個循環，步驟如下：rps4、trnL-trnF：95 ℃(25 s)，58 ℃(5 s)，72 ℃(2 min);atpB-rbcL、trnG：95 ℃(25 s)，47 ℃(5 s)，72 ℃(2 min)。擴增產物送上海歐易生物醫學科技有限公司測序，所測序列提交GenBank(表2)。

1.2.3數據處理將測序得到的序列逐一在線(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與GenBank中的進行比對，以排除有外源污染的序列存在。使用Clustal X 軟件[47]對待分析的序列進行自動和手動排列和比對，并切除序列兩端的模糊和不完全區段。利用MEGA 5.05[48]基于每個DNA片段構建系統樹，在樹形沒有顯著沖突的前提下再進行多序列合并數據集系統分析。本研究中的分類群包括了提燈蘚科、真蘚科、缺齒蘚科和寒蘚科(Meeseaceae)等；由于實驗中部分標本年代久遠未能用于分子系統分析，同時得到rps4、trnG、trnL-trnF和atpB-rbcL等4個序列的樣品只有40份。對于分類群數目較少、遠緣序列的分析使用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)可較好地避免“長枝吸引”假象的產生，從而構建出可靠的系統發育樹[49]。

表3　引物序列和來源

2　結果與分析

NJ和ML兩種分析方法對4個DNA片段聯合數據的分析結果基本一致，在此選用NJ樹來展示分析結果(圖1)，以疣壺蘚長尖變種定根，分子樹可分為A、B兩個自展支持率均為100%的主分支。

分支A由絲瓜蘚屬、提燈蘚屬(Mnium)、匍燈蘚屬(Plagiomnium)和疣燈蘚屬(Trachycystis)組成，包含了3個較大的次級分支。首先，2份泛生絲瓜蘚(Pohliacruda)、3份擬長蒴絲瓜蘚(P.longicollis)、粗枝絲瓜蘚(P.laticuspis)、2份南亞絲瓜蘚(P.gedeana)、絲瓜蘚(P.elongata)和黃絲瓜蘚(P.nutans)等聚成a支，雖然支持率不足50%，但有明顯的形態學共源性狀：植物體健壯；無葉腋生芽孢；孢蒴長，圓柱形，臺部明顯，與壺部等長，孢蒴外壁細胞長形，氣孔顯型；內齒層齒條有狹至寬的穿孔，有齒毛，長或短，有附片，或退化。該分支與Hill等[11]界定的絲瓜蘚組(Pohlia)包含的主要物種基本一致。其次，2份卵蒴絲瓜蘚(P.proligera)樣品和異芽瓜蘚(P.leucostoma)聚成b支，支持率為100%。該分支與Hill等[11]界定的直蒴蘚組(Cacodon)包含的主要物種基本一致，最明顯的特征是均有葉腋生芽胞。這個類群種間在生境、植株大小、葉的光澤度、葉形、葉細胞大小和形狀等方面十分相似，區別主要在芽胞的大小、形狀、數目和葉原基的分化程度，如果在無芽胞時，這些種很難區分。形態學上顯著的一致性證明它們系統關系密切[50]。再次，提燈蘚屬、匍燈蘚屬和疣燈蘚屬的種聚為c支，自展支持率為100%，支持了基于經典分類學的研究結果——提燈蘚科是一個單系類群。2份樹形疣燈蘚的同地標本分別聚在不同的次級分支中，可能是由于“長枝吸收”假象所致。

分支B包括真蘚屬、短月蘚屬、大葉蘚屬、平蒴蘚屬和銀蘚屬，共有的形態學性狀為：植物體小型，葉披針形至卵形，中上部細胞較短，長菱形至六邊形；孢子體生于莖頂；蒴齒發育常完全。與Crosby等[1]、Hill等[11]和Shaw等[2]界定的真蘚科范疇一致。

3　討　論

3.1絲瓜蘚屬與真蘚科的關系

在基于聯合分子數據分析得出的分子樹中，包含絲瓜蘚屬和提燈蘚科類群的分支A與包含真蘚科類群的分支B均有很高的支持率，與近年來的分子實驗結果[23-26]一致，進一步證明了絲瓜蘚屬不屬于真蘚科，而與提燈蘚科的關系更密切。在經典分類中主要基于孢子體的相似性將絲瓜蘚屬歸于真蘚科，但兩者的配子體有較多差異(圖2)：絲瓜蘚屬植物葉較狹長，長披針形至披針形，葉緣無分化邊，中肋及頂至消失于葉尖下，葉細胞狹長，蠕蟲形；真蘚科植物葉較寬，卵形、橢圓形、匙形或披針形，葉緣常有明顯分化邊，中肋強勁，貫頂、突出葉尖至形成長毛尖，葉細胞較寬，六邊形至長菱形。所以，綜合形態學性狀和分子序列分析，絲瓜蘚屬應移出真蘚科，這一觀點幾乎已達成共識，被廣泛應用到近期發表的文獻中[1-2,9-11, 14-15, 28, 41-42,51]。

分支上的數值表示自展支持率≥50%。A. 絲瓜蘚屬-提燈蘚科; B. 真蘚科；a. 絲瓜蘚組; b. 直蒴蘚組; c. 提燈蘚科圖1　rps4、trnG、trnL-trnF和atpB-rbcL聯合序列鄰接樹Numbers above branches are bootstrap values≥50% from 1 000 replicates. A. Pohlia-Mniaceae; B. Bryaceae；a. Section Pohlia; b. Section Cacodon; c. MniaceaeFig. 1　Consensus tree of neighbor-joining (NJ) tree derived from rps4+trnG+trnL-trnF + atpB-rbcL data

3.2絲瓜蘚屬與提燈蘚科的關系

盡管分子實驗結果中，絲瓜蘚屬植物與提燈蘚科科所含類群聚在一起，并有很高的支持率，但由于在系統演化過程中可能有遺傳滲漏或祖先多態性發生，所以分子樹未必與物種樹一致[52]，它們之間的系統發育關系有待更多證據的支持。從形態性狀比較(圖2)：絲瓜蘚屬植株一般較小，葉形和葉細胞狹長，生殖苞常生于主莖基部的新生枝頂，內層蒴齒有不同程度的退化；提燈蘚科植株一般大型，葉片常短而闊，葉細胞幾乎等徑，孢子體常生于主莖頂，蒴齒發育完全。對以形態學性狀為基礎的經典分類學結果與以分子證據為基礎的現代分類學結果的沖突，可能的解釋是這兩個類群始于共同祖先，在較晚期發生分歧，由于某個或某些地質歷史事件的原因，存在缺失類群，孑遺類群之間親緣關系距離遠，所以沒有相似形態學性狀。由于二者形態學上有較大差異，有人提出以經典分類建立起來的兩個分類群在幾乎找不到相似形態性狀的情況下，不應該視為一個類群，絲瓜蘚類群可能是早期從廣義的提燈蘚科分出并平行演化而來的[2]。基于絲瓜蘚屬與提燈蘚科之間無形態學共源性狀，那么它們就不應被視為一個單系類群，獨立缺齒蘚科勢在必行。Hill等[11]參照Koponen[27]的小科概念將Goffinet等[28]提出的提燈蘚科進行拆分，將絲瓜蘚屬、缺齒蘚屬、小葉蘚屬和斯克蘚屬等類群獨立為缺齒蘚科，Crosby等[1]、Shaw[2]和Shaw等[51]一些學者支持并采納了這個觀點。Cao等[53]利用紅外光譜分析探討絲瓜蘚屬與提燈蘚科的系統關系，支持了絲瓜蘚屬歸于缺齒蘚科的觀點。

3.3絲瓜蘚屬與缺齒蘚屬、小葉蘚屬等類群的關系

由于小葉蘚屬的蒴齒結構與絲瓜蘚屬的幾乎無差別，Andrews[54]和Ochi[55]曾將其作為絲瓜蘚屬的一個組。在Pedersen等[25-26]基于形態學性狀和cpDNA序列綜合分析得出的系統發育樹中小葉蘚屬與絲瓜蘚屬關系密切。Guerra等[56]通過cpDNA序列分析也得到了相似的結果，認為小葉蘚屬與Hill等[11]定義的絲瓜蘚屬廣口蘚組(Apalodictyon)構成關系密切的姊妹群。從形態學特征分析不難發現它們的共源性狀是闊菱形的葉細胞。缺齒蘚屬與絲瓜蘚屬的絲瓜蘚組有相似的配子體，二者的區別主要是蒴齒結構：絲瓜蘚組的蒴齒明顯兩層，有發育良好的外齒層和發育良好或一定程度退化的內齒層；缺齒蘚屬常僅有退化的外齒層，有時也有基膜或不明顯的內齒層[57]。缺齒蘚屬與絲瓜蘚屬為并系類群得到分子證據支持[23-24]。絲瓜蘚屬與合齒蘚屬、擬絲瓜蘚屬的系統關系盡管暫無分子證據，但若無孢子體、僅以配子體幾乎無法區分這三屬植物，依據形態性狀的相似性可以認為它們是系統關系密切的類群，一并歸于缺齒蘚科[1, 2]。

4　結　論

4.1缺齒蘚科是一個獨立類群

基于形態學性狀和分子序列的綜合分析，缺齒蘚類群應移出真蘚科；基于與提燈蘚科缺乏形態學性狀的共源性，缺齒蘚類群也不應置于提燈蘚科。根據形態結構由復雜到簡化的生物演化路線推測，具有發育相對完整的雙層蒴齒結構的合齒蘚屬可能與絲瓜蘚屬較原始的類群系統關系密切；具有極度退化的蒴齒結構的缺齒蘚屬則屬于另一種情況，即與絲瓜蘚屬較進化的類群系統關系密切。以相似的葉形和葉細胞推斷小葉蘚屬可能與絲瓜蘚屬的廣口蘚組系統關系密切。除蒴齒結構外，幾乎無法找到擬絲瓜蘚屬與絲瓜蘚屬其它形態學性狀的差異，所以它們可能起源相同或相似。總之，缺齒蘚科應是一個自然類群，缺齒蘚科內屬間存在著密切的系統發育關系。

缺齒蘚科主要識別特征為：植物體小型，莖常分枝；葉形和葉細胞為絲瓜蘚型(Pohlia-like)，披針形至長橢圓形，中上部細胞狹長，線狀菱形或蠕蟲形；生殖苞多生于新生枝頂；蒴齒為互生雙齒層，常有不同程度的退化或一層蒴齒缺失，稀雙層蒴齒缺失。

4.2中國缺齒蘚科分類

中國缺齒蘚科目前有5屬，34種(含種下分類單位)。

中國缺齒蘚科分屬檢索表

1. 植株稍扁平，有1～3列比側葉小的背葉；葉橢圓形，葉邊有1～4列狹長細胞構成的分化邊

小葉蘚屬Epipterygium

1. 植株不扁平，無背葉和側葉之分；葉披針形至長披針形，葉邊無明顯狹長細胞構成的分化邊

2

2. 蒴齒常退化，雙層或單層，稀缺失

缺齒蘚屬Mielichhoferia

2. 蒴齒明顯雙層

3

3. 內齒層粘貼于外齒層上，不易分離，相鄰的齒毛相互貼合，與齒條不易區分

合齒蘚屬Synthetodontium

3. 內齒層與外齒層分離，若有齒毛易與齒條區分

4

4. 孢蒴直立，蒴齒成對并合，內齒層與外齒層等長

擬絲瓜蘚屬Pseudopohlia

4. 孢蒴傾立至下垂，蒴齒分離不并合，內齒層較外齒層短

絲瓜蘚屬Pohlia

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(編輯:潘新社)

Phylogeny and Classification of the Moss Family Mielichhoferiaceae in China Inferred from Chloroplast DNA Sequences and Morphology

LIU Yongying1,2, NIU Yulu2,3,CAO Zhen2, ZHAO Jiancheng2*

(1 Department of Biology, Jiaozuo Teachers College, Jiaozuo, He’nan 454001, China; 2 College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China; 3 College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

The paper aims to discuss the relationship betweenMielichhoferiagroup and Bryaceae, to identify morphological synapomorphy betweenMielichhoferiagroup and Mniaceae, to solve the problem of systematic position ofMielichhoferiagroup, to figure out the classification of Mielichhoferiaceae in China. Morphological characters of more than 4 000 specimens of Mielichhoferiaceae and its related groups in China were analyzed. And then, neighbor joining (NJ) and maximum likelihood (ML) tree were built based on combinedtrnG,rps4,trnL-trnF, andatpB-rbcL cpDNA sequences of 40 specimens for 35 species. Combining morphological and molecular data in the analyses showed that: (1) not only wereMielichhoferiagroup and Bryaceae family in the different clades in the molecular tree, but also morphological features, such as the leaf shape, the leaf cells of the two groups were different.Mielichhoferiagroup should be separated from Bryaceae. (2) No morphological synapomorphy can be detected forMielichhoferiagroup and Mniaceae family, although they were in the same clade in the molecular tree. The two groups were not monophyletic. (3) Mielichhoferiaceae is a natural monophyletic group. In Mielichhoferiaceae, the plants are small, stems tend to be much branched than in Bryaceae; leaves arePohlia-like in shape and areolation; gametangia are often produced on lateral branches or the base of stems; peristome is diplolepideous-alternate, often reduced to one layer or rarely absent. (4) There are five genera,Mielichhoferia,Pohlia,Pseudopohlia,SynthetodontiumandEpipterygium, in Mielichhoferiaceae in China, total 32 species and 2 variaties.

Mielichhoferiaceae; Bryaceae; Mniaceae; morphological characters; molecular tree; classification

1000-4025(2016)07-1366-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1366

2016-05-18;修改稿收到日期:2016-06-27

國家自然科學基金(31370237)；河南省自然科學基金(152300410176)； 河北省自然科學基金(C2016111016)；河南省高等學校重點科研項目(15B180007)

劉永英(1969-)，女，博士，副教授，研究方向為苔蘚植物學。E-mail: jzbotany@163.com

趙建成，教授，博士生導師，主要從事苔蘚植物學研究。E-mail: zhaojiancheng@hebtu.edu.cn

Q949.35

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