雙醛低聚異麥芽糖交聯脫細胞豬真皮基質的研究

陳一寧，但年華,2，王　磊，何　燦，但衛華,2

(1. 四川大學 皮革化學與工程教育部重點實驗室， 成都 610065；2. 四川大學 生物醫學工程技術研究中心， 成都 610065)

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雙醛低聚異麥芽糖交聯脫細胞豬真皮基質的研究

陳一寧1，但年華1,2，王磊1，何燦1，但衛華1,2

(1. 四川大學 皮革化學與工程教育部重點實驗室， 成都 610065；2. 四川大學 生物醫學工程技術研究中心， 成都 610065)

采用新型交聯劑氧化低聚異麥芽糖(IMODA)交聯脫細胞豬真皮基質(pADM)，優化最佳交聯條件，考察了交聯材料(IMODA-pADM)的收縮溫度、改性指數、傅里葉紅外光譜、機械性能、親水性、吸濕性、表面形貌、耐酶解性能及細胞相容性。結果顯示，交聯材料的收縮溫度隨IMODA的用量、反應溫度、反應時間的增加而先增大后趨于穩定，隨pH值的增加而先增大后減小。交聯最優條件為，反應溫度37 ℃、用量16%、反應時間18h、pH值為9.4；隨用量增大，交聯材料改性指數增大，物理機械性能提高，親水性與吸濕性略有降低，耐酶解性能大幅提高；交聯后材料更為緊實，材料表面有利于細胞粘附生長，細胞形態良好，細胞毒性為0-Ⅰ級。

交聯；雙醛低聚異麥芽糖；脫細胞豬真皮基質

0　引　言

膠原是最重要的細胞外基質之一，為水不溶性纖維蛋白，是動物體內含量最多的蛋白質，廣泛存在于皮膚、韌帶、肌腱、軟骨等結締組織或器官中，具有其它高分子材料不可比擬的生物學性質及生物降解性[1-2]。脫細胞豬真皮基質(pADM)除去了豬真皮中的細胞成分，只保留了膠原纖維支架，是良好的生物醫用材料，但變性溫度低、機械強度低及耐蛋白酶降解能力差等特點在一定程度上限制了其應用，需要通過交聯改性來改善pADM的物理機械性能、穩定性、降低抗原性，調節適宜的降解性。常用改性膠原的化學改性劑包括：醛類、環氧化合物、碳化二亞胺、己二異氰酸酯、納米材料等[3]，但化學改性劑往往會對材料的生物學性能造成一定不良影響。天然糖類廣泛存在與自然界中，具有安全無毒、能夠在體內降解代謝、具有較高的生物活性等特性。雙醛多糖是近年來膠原改性劑的研究熱點之一，由于醛基具有較高的反應活性，使雙醛多糖具有交聯膠原的可能性[4]。目前雙醛海藻酸鈉等雙醛多糖已應用于膠原類材料的改性，效果良好，且生物相容性俱佳[5]。但雙醛多糖分子量大，對于致密的膠原組織存在滲透性差、內部交聯困難的缺點。低聚異麥芽糖(Isomaltooligosaccharide，IMO)又稱分枝低聚糖，是指一類由2～10葡萄糖以α-1，6糖苷鍵結合而成的低聚糖[6]，與多糖相比，既保留了分子的主要結構單元，同時分子量小，水溶性好，滲透快。將IMO選擇性氧化后制備的氧化低聚異麥芽糖(IMODA)作為新型交聯劑，用于具有致密結構的pADM的交聯，有望繼承氧化多糖交聯的優點，克服其缺點。交聯后的膠原pADM，成為糖基化修飾膠原，兼具兩者的優點，且分子之間為共價鍵結合，結構穩定均一，具有共混不可擬的優越性。本文以脫細胞豬真皮基質中的膠原纖維為膠原模板，以IMODA為交聯劑，研究兩者之間的交聯作用及產物的性能。

1　實驗材料和儀器

脫細胞豬真皮基質[7]，自制；氧化低聚異麥芽糖(氧化度69%)，自制；數字式皮革收縮溫度測定儀，MSW-YD4，陜西科技大學陽光電子研究所；冷凍干燥機，Freeze6，美國Labconco；傅里葉紅外光譜儀，MAGNAIR560，美國Nicole；電子拉力機，GT-AI-7000S，臺灣高鐵科技股份有限公司；二氧化碳培養箱，3111，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；酶標儀，BIO-RAD680，美國伯樂公司；細菌Ⅰ型膠原酶，生化級，Sigma-Aldrich公司；改良型RPMI-1640培養基，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清，上海復蒙基因生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

2　實驗內容及方法

2.1交聯反應及條件優化

將一定質量的IMODA溶解于盛有緩沖溶液的錐形瓶中，加入pADM，使其完全浸沒于溶液中，置于可控溫的搖架中反應。采用單因素法分別對IMODA用量、反應溫度、反應時間、反應體系pH值進行優化。反應結束后用蒸餾水反復清洗以除去未反應完的IMODA，冷凍干燥，備用。

2.1.1反應時間

控制反應溫度為37 ℃，IMODA用量為pADM干重的8%(質量分數)，pH值8.4，反應時間分別為6，12，18和24h。

2.1.2反應溫度

控制IMODA用量為pADM干重的8%(質量分數)，pH值8.4，分別在27，32，37和42 ℃的溫度條件下反應18h。

2.1.3IMODA用量

在37 ℃、pH值8.4下，選取IMODA的用量分別為pADM干重的4%，8%，12%，16%和20%，反應18h。

2.1.4反應體系pH值

在37 ℃下，加入pADM干重16%的IMODA，在pH值分別為7.4、8.4、9.4、10.4的緩沖溶液中反應18h。

2.2交聯材料的性能表征

2.2.1收縮溫度

將IMODA交聯pADM得到的材料(IMODA-pADM)制成5mm×70mm，測定其收縮溫度，每個試樣測3個平行樣。

2.2.2自由氨基與改性指數

通過茚三酮比色法，測得交聯材料的自由氨基量[8]，按式(1)計算得到改性指數。

(1)

2.2.3傅里葉紅外光譜(FT-IR)

將不同交聯劑用量得到的IMODA-pADM刮取少量纖維，與適量KBr研磨，壓制成片，在傅里葉紅外光譜儀上測定，設置掃描波數450～4 000cm-1，分辨率4cm-1，掃描次數32次。

2.2.4物理機械性能

將不同交聯劑用量的交聯材料制成啞鈴狀，空氣調節48h后，在拉力機上以100mm/min速度測定抗張強度與斷裂伸長率，每個式樣測定3個平行樣[9]。

2.2.5吸濕率、吸附水率與溶脹率

測定并計算不同交聯劑用量得到的IMODA-pADM的吸濕率、吸附水率與溶脹率[10]

2.2.6親水性

將不同交聯劑用量得到的IMODA-pADM制成15mm×70mm大小，采取坐滴法，以6μL新煮沸并冷卻的蒸餾水液滴滴于材料表面上，測得接觸角，每個式樣測定5個平行樣。

2.2.7SEM

通過掃描電子顯微鏡(SEM)對交聯前后材料表面進行形態學觀察。

2.2.8耐酶降解性能分析

采用細菌Ⅰ型膠原酶對交聯材料的耐酶降解性能進行了考察。取一定質量(記為W1)交聯材料放入含有細菌Ⅰ型膠原酶的培養液(1U/mL，3mL/mgpADM樣品)中在37 ℃下孵化7d。分別在第1，2，4和7d取出樣品，用蒸餾水清洗3次后，冷凍干燥，稱重(記為W2)。樣品的降解率由式(2)計算得出

(2)

2.2.9細胞毒性測定

采用L929成纖維細胞，測定最佳交聯條件下制備的IMODA-pADM的浸提液細胞毒性及接觸細胞毒性[11]。

3　結果與討論

3.1交聯反應條件優化

脫細胞豬真皮基質材料的主要成分是膠原(纖維)，具有許多可參與交聯反應的活性基團，如氨基、羧基、巰基等。IMODA中富含醛基，鏈長適宜，故它能夠與pADM產生單點或多點結合，在膠原纖維內部與膠原纖維間形成穩定交聯，從而提高材料的濕熱穩定性能，在宏觀上表現為交聯材料收縮溫度的提高。

3.1.1反應時間對交聯材料收縮溫度的影響

如圖1所示，隨著反應時間的延長，IMODA-pADM收縮溫度(Ts)先增大后略有降低，18h時收縮溫度最高。當反應時間小于18h時，隨著反應時間的延長，膠原上更多的活性基團逐步與IMODA發生反應，18h后，一方面，可參與反應的活性基團反應趨于完全，反應逐漸減緩；另一方面，膠原在反應介質中的長時間浸漬可能會導致膠原纖維間的部分連接松弛甚至斷裂，綜合而言反而使得收縮溫度略有下降。故反應溫度以18h為宜。

圖1　反應時間對交聯材料收縮溫度的影響

Fig1TheeffectofhourstotheTsofIMODA-pADM

3.1.2反應溫度對交聯材料收縮溫度的影響

在化學反應中，升高溫度能使反應體系能量增加，有利于加速分子熱運動，分子間的有效碰撞增多，更多的分子突破反應的活化能而發生反應，有利于反應速度的加快。此外，醛基與氨基的反應為吸熱反應，升高溫度有利于化學平衡向生產產物的反向轉變。由圖2可見，隨著反應溫度的升高，IMODA-pADM的收縮溫度先升高后降低。當反應溫度較低時(<37 ℃)，提高溫度，有利于更多的IMODA分子和膠原上的活性基團克服能壘而發生結合，故在相同時間內交聯程度得以提高。再繼續升高溫度(>37 ℃)，材料的收縮溫度無明顯提高。可能是反應進行的同時，pADM中膠原纖維部分連接松弛甚至斷裂，會導致收縮溫度略有降低。故最適反應溫度為37 ℃。

圖2　反應溫度對交聯材料收縮溫度的影響

Fig2Theeffectoftemperaturetotheshrinkagetemperatureofcrosslinkedmaterials

3.1.3IMODA用量對交聯材料收縮溫度的影響

發生化學反應時，反應物用量的增加有利于反應向右進行。膠原上的活性基團是一定的，可以通過增加IMODA用量，來控制其交聯程度。IMODA用量增加，其與膠原間形成的單點結合與多點交聯都有所增加，從而使交聯程度增加，材料的耐濕熱穩定性提高。由圖3可知，隨著IMODA用量增大，IMODA-pADM的收縮溫度與先增大后略有降低。當IMODA用量較小時(<16%)，參與交聯反應的膠原中的活性基團較少，交聯程度較低，收縮溫度較低；用量增大后，膠原分子中更多的活性基團與IMODA中的醛基作用，交聯反應發生的可能性增大，交聯程度提高，收縮溫度增大；當用量過大時，IMODA分子中的醛基間會產生競爭，收縮溫度略有降低。

圖3　用量對交聯材料收縮溫度的影響

Fig3Theeffectofdosagetotheshrinkagetemperatureofcrosslinkedmaterials

3.1.4反應體系pH值對交聯材料收縮溫度的影響

圖4　pH值對交聯材料收縮溫度的影響

Fig4TheeffectofpHtotheshrinkagetemperatureofcrosslinkedmaterials

3.2交聯材料的性能表征

3.2.1用量對交聯材料改性指數的影響

已有研究表明，在堿性條件下，膠原側鏈賴氨酸中的ε-氨基是膠原側鏈氨基酸殘基中最具反應活性的基團[11]。膠原的鏈端及側鏈上含有大量活性氨基(自由氨基)，IMODA中的醛基可與其反應形成席夫堿交聯結構，故可由自由氨基的變化(改性指數)來表征IMODA與pADM的改性程度。由圖5可見，隨著IMODA用量的逐漸增加，IMODA-pADM的改性指數逐漸增大后略有降低。當用量較小時，有限的IMODA與pADM中的氨基發生交聯反應，消耗的氨基數量較少，故而改性指數較低；增大交聯劑用量，大量醛基與氨基發生反應，氨基數量進一步降低，改性指數逐步增大；當用量為16%時，改性指數最大。此外，對于生物材料而言，自由氨基數量的降低有利于降低材料的抗原性。

圖5　用量對交聯材料改性指數的影響

Fig5Theeffectofdosagetothemodificationindexofcrosslinkedmaterials

3.2.2不同用量交聯材料的紅外光譜(FT-IR)

圖6不同用量IMODA交聯的IMODA-pADM紅外圖譜

Fig6FT-IRspectraofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

3.2.3用量對交聯材料的物理機械性能的影響

如表1所示，隨著IMODA用量的增加，IMODA-pADM的抗張強度逐漸增大，斷裂伸長率逐漸降低。表明交聯反應使IMODA-pADM的力學強度得到了提高，這與耐濕熱穩定性的提高是一致的。良好的力學強度能夠保證IMODA-pADM在作為生物材料的使用過程中具有避免由于擠壓、拉伸等原因而產生變形的能力。IMODA-pADM的斷裂伸長率的降低可能是交聯發生在膠原纖維分子內、分子間及微纖維間，促使膠原纖維內形成了較為穩定的“剛性結構”，纖維發生了某些定向的聚集，在拉伸的過程中，不容易發生形變，較易引起應力集中，導致“脆斷”的發生，從而降低了相應的斷裂伸長率[12]。

表1不同用量交聯的IMODA-pADM抗張強度及斷裂伸長率

Table1TensilestrengthandlongationatbreakofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

IMODA用量/%抗張強度/MPa斷裂伸長率/%01.31±0.1220.46±1.1242.27±0.0914.88±0.8582.37±0.2011.31±1.19122.89±0.098.83±0.95163.23±0.176.40±2.10203.05±0.215.45±1.34

3.2.4用量對交聯材料吸濕性、吸附水率與溶脹率的影響

由圖7可知，隨著IMODA的用量增加，IMODA-pADM吸濕性、吸附水率與溶脹率均有下降。這可能是由于IMODA與pADM發生交聯反應封閉了親水基團氨基，隨著IMODA用量的增加，交聯反應的程度加深，未封閉的親水基團數量減少，于是導致了吸濕性和吸附水率的下降。同時隨著交聯反應的程度加深，pADM纖維被拉緊，間隙變窄，自由水含量減少，溶脹率下降。

圖7不同用量交聯的IMODA-pADM的吸濕性、吸附水率與溶脹率

Fig7Moisturerate,swellingrateandcapillarywaterabsorptionrateofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

3.2.5用量對交聯材料親水性的影響

由圖8可以看出，隨著IMODA的用量增加，IMODA-pADM的接觸角有所增加，親水性略有降低，變化并不明顯。這與交聯材料的吸濕性、吸附水率與溶脹率的變化是一致的。

圖8　不同用量交聯的IMODA-pADM接觸角

Fig8ContantangleofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

3.2.6交聯前后材料表面形貌觀察

pADM是由膠原纖維無規編織而成，纖維之間存在大量不規則的間隙。圖9顯示，在最優條件下交聯后得到的交聯材料(16%-IMODA-pADM)膠原纖維的天然基本結構不變，膠原纖維縱橫交錯，同時保持著較高的孔隙率，孔徑大約在30～100μm間。一般來說，材料孔徑在20～120μm時，對成纖維細胞的生長十分有利，說明制備的IMODA-pADM適宜于用作細胞生長支架。當交聯劑用量較大時(如16%)，纖維間隙略感變窄。

圖9　交聯前后pADM表面SEM圖片

Fig9SEMphotographsofpADMbeforeandaftercrosslinking

3.2.7耐酶降解性能分析

由圖10可以看出，用量為4%，8%，12%，16%和20%的氧化低聚異麥芽糖改性pADM在Ⅰ型膠原酶中均呈現出很強的抵抗降解的能力，經過1d的降解未交聯組降解了約45%，而交聯組降解均小于6%，且氧化低聚異麥芽糖用量越大，其降解率越低。

圖10不同用量氧化低聚異麥芽糖改性pADM在Ⅰ型膠原酶中的降解曲線

Fig10ResistancetodegradationofIMODA-pADMwithdifferentdosageofIMODA

經過2d的作用后，未交聯組接近完全降解。經過7d的作用后，4%-IMODA-pADM降解率為16.5%±1%，8%-IMODA-pADM降解率為10.1%±1.4%，12%-IMODA-pADM降解率為8.4%±0.5%，16%-IMODA-pADM降解率為7.0%±0.2%，而20%-IMODA-pADM降解率僅為6%±0.7%，說明使用IMODA交聯pADM可大幅提高材料的耐酶降解性能，這與IMODA-pADM的耐濕熱穩定性是一致的。材料抗酶解能力的提高一方面得益于IMODA與pADM可形成分子內交聯、分子間交聯及微纖維間的交聯，即在材料內形成體型結構交聯使材料的結構穩定性大幅增強。另一方面是由于交聯后膠原結構稍有緊實，具有更低的表面積。因為酶主要影響基質表面，相對于非交聯的膠原，單位時間內膠原酶將降解更少的交聯過的膠原。

3.2.8交聯材料細胞毒性

表2顯示，最優條件下交聯得到的16%-IMODA-pADM浸提液細胞毒性為0-Ⅰ級，生物相容性良好，符合體表使用要求。圖11為細胞在IMODA-pADM材料上生長的SEM圖片，可以看出細胞生長狀態良好，形態飽滿為梭形，牢牢地粘附于IMODA-pADM的纖維上生長，證明了IMODA作為膠原改性劑生物相容性能優良。IMODA是由天然產物低聚麥芽糖經選擇性氧化而得，只有部分糖基被氧化，保留了糖分子的大部分結構，因而保留了良好的生物相容性。將其作為膠原交聯劑，克服了合成交聯劑本身生物毒性大以及可能導致試劑殘留的缺陷，不會對膠原的生物相容性造成不良影響，因而幾乎無細胞毒性。

表2　IMODA-pADM浸提液細胞毒性實驗結果

圖11L929成纖維細胞在16%-IMODA-pADM上生長3d后掃描電鏡圖(×1 000，×2 000)

Fig11SEMphotographsofL929fibroblastculturedfor3don16%-IMODA-pADM(×1 000,×2 000)

4　結　論

膠原具有優異的生物相容性，但也存在耐降解能力差等缺陷。合成交聯劑雖然具有結構可控性強的優點，但也存在制備副產物難以純化以及試劑殘留的不足。從植物中提取的交聯劑(如京尼平)，往往價格昂貴，難以產業化應用。天然多糖廣泛存在于動物細胞膜和植物、微生物的細胞壁中，也是構成生命的四大基本物質之一，具有優良的可降解性、生物相容性等優點，但分子量大，水溶性不佳，反應能力不足。氧化寡糖保留了多糖的主要鏈單元結構，保留其多糖的主要功能性(可降解性、生物相容性)，同時分子量更小、水溶性更佳；通過選擇性部分氧化得到的醛基，同時賦予其優良的化學活性(交聯性)，特別適用于交聯具有緊密結構的生物材料(如含氨基的多糖、膠原等)，能夠深入滲透到生物材料結構中，并產生穩固的交聯結構，得到的交聯材料，交聯程度高、生物相容性好。本文以價格低廉的低聚異麥芽糖經氧化后得到的雙醛低聚異麥芽糖為原料，對pADM(膠原)進行交聯改性，證明氧化寡糖作為新型生物交聯劑，具有優良的性能，有望廣泛應用于生物材料領域。

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Studyonprocineacellulardermalmatrixcrosslinkedbyisomaltooligosaccharidedialdehyde

CHENYining1,DANNianhua1,2,WANGLei1,HECan1,DANWeihua1,2

(1.KeyLaboratoryofLeatherandEngineeringofMinistryofEducation,SichuanUniversity,Chengdu610065,China;2.NationalEngineeringLaboratoryforCleanTechnologyofLeatherManufacture,SichuanUniversity,Chengdu610065,China)

Porcineacellulardermalmatrix(pADM)wascrosslinkedbyanewtypecrosslinkerwhichiscalledisomaltooligosaccharidedialdehyde(IMODA),thecrosslinkingconditionswereoptimized.themodificationindex,fouriertransforminfraredspectroscopy,mechanicalproperties,hydrophilicity,scanningelectronmicroscopyandthecytotoxicityofIMODA-pADMweretested.Theresultsindicatedthatwhenthedosage,reactiontemperatureandreactiontimewereincreased,theshrinkagetemperaturewasincreasedfirstlyandthengraduallystayedsteady,whenthepHvaluewasincreased,theshrinkagetemperaturewasincreasedfirstlyandthendecreased.Itwasshowedthatthecomprehensiveperformancewasbestwhenthereactiontemperaturewas37 ℃,thereactiontimewas48h,dosagewas16%,pHvaluewas9.4.Aftercrosslinking,thetensilestrengthofIMODA-pADMwasimproved,thehydrophilicitywasweakened,thesurfaceofthematerialisconducivetotheadhesionandgrowthofcells,andthectotoxicitygradeofcrosslinkedmaterialwasgrade0-Ⅰ.

crosslink;isomaltooligosaccharidedialdehyde;porcineacellulardermalmatrix

1001-9731(2016)05-05195-06

國家自然科學基金資助項目(51473001)；大學生創新創業計劃資助項目(201510610972)

2015-10-10

2015-11-26 通訊作者：但年華，E-mail:lamehorse-8@163.com

陳一寧(1991-)，女，成都人，在讀碩士，師承但衛華教授，從事膠原基生物醫用材料研究。

R318.08

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.05.037