葡萄糖氧化酶在修飾玻碳電極上的直接電化學*

耿方勇,李　迪,張鈺帥,楊曉璐,肖寶林,洪　軍

(河南大學生命科學學院，河南　開封　475000)

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葡萄糖氧化酶在修飾玻碳電極上的直接電化學*

耿方勇,李迪,張鈺帥,楊曉璐,肖寶林,洪軍

(河南大學生命科學學院，河南開封475000)

將葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)固定在由多壁碳納米管(MWCNTS)和石墨烯(Graphene)構成的納米復合材料修飾的玻碳電極上，最外層用殼聚糖(Chitosan)進行覆蓋，利用循環伏安法(Cyclic Voltammetry, CV)來測量葡萄糖氧化酶在修飾電極上的電化學和電催化反應，測得電子傳遞速率常數ks為0.87 s-1，電活性物質表面密度Г為1.54×10-10mol/cm-2,動力學表觀米氏常數Km為1.32×103μmol/L,線性檢測范圍為：40～1000 μmol/L，修飾電極有較好的穩定性，而且修飾電極在檢測底物時有較好的抗干擾能力，因此，該體系修飾的電極有希望構建第三代葡萄糖生物傳感器。

石墨烯；多壁碳納米管；直接電化學；穩定性；抗干擾

葡萄糖氧化酶由于具有催化專一性、高活性、催化高效性、對人體無毒副作用等優點被廣泛地應用于許多方面，如在食品工業，可用于去葡萄糖、脫氫、殺菌；在飼料添加方面，是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境[1]。同時，在生物方面，用來構建生物傳感器是最具有商業價值的。

增加氧化還原蛋白質的直接電子轉速率是開發生物傳感器、生物燃料電池的先決條件。然而,蛋白質活性中心與電極表面進行直接電子通信是困難的, 正如葡萄糖氧化酶，其起到傳遞電子作用的活性中心FAD是深深嵌入蛋白質結構的內部[2-3]。因此通過各種方法使兩者之間能夠進行電子通信是首要問題。

隨著納米技術的發展，納米材料的應用已滲透到傳感器的設計中，石墨烯具有極大的比表面積和良好的電子傳遞性能，并有很好的生物相容性，在酶的直接電化學、生物小分子的電化學檢測中都具有極其優異的性能[4]。多壁碳納米管具有較大比表面積、化學穩定性好、生物兼容性好、具有良好的電子傳遞能力，被廣泛的應用于生物傳感器領域中[5]。

由于石墨烯為單層的片狀結構，多壁碳納米管為管狀結構，綜合二者優點制作復合材料，將管狀的多壁碳納米管復合在單層片狀結構的石墨烯上，從而增大酶的附著量，并提高酶的活性中心與電極之間的電子傳遞速率。

本文將從葡萄糖氧化酶固定于修飾有納米高分子復合材料的玻碳電極表面，通過循環伏安測試法研究酶在電極上的電化學行為及電化學特性，實現了直接電化學研究。

1　實　驗

1.1儀器

KQ-100B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； CHI650C電化學分析儀，上海辰華儀器公司； PHS-3C型精密酸度計，上海大普儀器公司；CP214型電子天平，河南中良科學儀器有限公司。

1.2試劑

葡萄糖氧化酶、多壁碳納米管、石墨烯、殼聚糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖(Glucose, Glu)，均購于Sigma公司；其它試劑均為分析純，所有溶液均用去離子雙蒸水配置。

2　結果與討論

2.1不同修飾材料循環伏安曲線對比

圖1　不同修飾材料循環伏安曲線對比圖

在50 mmol/L PBS溶液緩沖液(pH 7)中，采用CV法對修飾電極的電化學行為進行研究，掃描速率為0.05 V/s。圖1顯示了不同修飾電極的循環伏安圖：曲線a、b均為無明顯氧化還原峰，而曲線c在-0.1～ -0.3之間具有一對明顯的氧化還原峰，實驗結果表明GOD在納米復合材料修飾的玻碳電極上具有電化學活性，是一準可逆的電子傳遞氧化還原反應過程[6-7]。

2.2循環伏安法測量GOD電化學反應機制

圖2　不同掃描速度CV曲線圖(A)，不同掃描速度GOD峰電流值與掃描速度圖(B)和GOD峰值電壓與掃描速度對數圖(C)

圖2(A)顯示了在50 mmol/L PBS溶液緩沖液(pH 7)中，不同掃描速率下修飾電極CV曲線圖。

圖2(B)顯示在掃描速率為0.01～0.4 V/s范圍內，陰極峰電流和陽極峰電流二者與電壓成線性關系，這說明了GOD與電極之間的電子傳遞過程是固化機制[8]。

峰值電壓與掃描速度自然對數的線性關系如圖2(C)所示，修飾電極在掃描速率0.2～0.4 V/s的范圍內，陰極峰電壓變化(Epc)與lnv成線性關系為。

根據Laviron公式：

(1)

式中：α——陰離子遷移系數

n——電子數

R——氣體常數，R=8.314 J·mol-1·K-1

F——法拉第常數，F=96493 C/mol

T——溫度，T=298 K

根據公式(1)計算得α·n=1.15 (0.3<α<0.7)，n=2, 說明了GOD與電極之間的氧化還原反應是雙電子傳遞過程。

(2)

根據公式(2)可以計算出電子遷移速率常數(ks)[9-10],由圖C中兩條趨勢線交點可以計算出lnv=-2.754；ks=0.87 s-1。

再根據公式

(3)

式中：A——電極表面積

Γ——電活性物質表面密度

得出表面密度Γ為1.54×10-10mol/cm2，和PDB單層理論值1.7×10-10mol/cm2十分接近，因此酶在修飾電極上是單層分布的，這主要是由于納米復合材料具有較大的比表面積，能夠使酶穩定的附著在其表面。

2.3對葡萄糖的檢測

圖3　峰值電流隨底物濃度變化圖(插圖為GOD ineweaver-Burk圖)

圖3為全修飾電極在Glu存在時峰值電流與Glu濃度關系圖，從圖3中可以得出修飾體系的線性檢測范圍為40～1000 μmol/L。

圖3中插圖表示的是對于固定化的GOD，催化電流與底物濃度之間的關系遵循米氏動力學機制：

3　Chi/MWCNTs/Graphene/GOD/GC電極抗干擾實驗

對全修飾的電極進行抗干擾實驗，如圖4所示，先后加入葡萄糖溶液，電流均有較明顯的下降，待電流穩定后加入維生素B1，電流并未有所改變，再加入葡萄糖溶液后，電流又有明顯下降，接著加入抗壞血酸和尿酸后均未產生電流變化，最后再次加入葡萄糖溶液，電流再次降低，因此，構建的電極體系具有很高的選擇性，抗干擾能力強。

圖4　電流-時間曲線

此外研究修飾電極的穩定性，將電極在反應池中浸泡0.5 h后采用CV法進行多次掃描，曲線幾乎重合；將初始電極放置一天一夜后測量其信號強度，達到初始信號強度的96.7%，因此本實驗構建的全修飾電極有較好的穩定性。

4　結　論

葡萄糖氧化酶在石墨烯-多壁碳納米管復合材料修飾的電極上可實現直接電子轉移，進行直接電化學，修飾電極對葡萄糖具有生物催化活性，檢測范圍為40～1000 μmol/L，構建的體系具有較高的選擇性，抗干擾能力強，穩定性好，因此該體系有希望用于檢測葡萄糖濃度，構建第三代生物傳感器。

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Direct Electrochemistry of Glucose Oxidase on A Nano Complex Modified Glassy Carbon Electrode*

GENGFang-yong,LIDi,ZHANGYu-shuai,YANGXiao-lu,XIAOBao-lin,HONGJun

(School of Life Sciences, Henan University, Henan Kaifeng 475000, China)

graphene; multi-walled carbon nanotubes; direct electrochemistry; stability； anti-interference

河南大學特聘教授科研啟動基金(No：5443D0810)。

耿方勇(1994-)，男，河南大學生命科學學院研究生。

洪軍，博士，校特聘教授，碩士生導師。

O646

A

1001-9677(2016)07-0122-03