低濃度岡田酸對人肝癌細胞SMMC-7721生長的影響*

鄒倩倩，晏　容，3，劉　云，劉　流，李曉飛，3△（.遵義醫學院基礎醫學院，貴州遵義563003；2.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州遵義563003；3.貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，遵義563003）

低濃度岡田酸對人肝癌細胞SMMC-7721生長的影響*

鄒倩倩1，晏容1，3，劉云2，3，劉流1，李曉飛1，3△
（1.遵義醫學院基礎醫學院，貴州遵義563003；2.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州遵義563003；3.貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，遵義563003）

目的探討低濃度岡田酸（OA）對人肝癌細胞SMMC-7721生長的影響。方法（1）采用磺酰羅丹明（SRB）染色法檢測不同低濃度OA（5.900 00、0.590 00、0.059 00、0.029 50、0.014 75 nmol/L）在體外對人肝癌細胞SMMC-7721的促增殖作用；（2）應用免疫熒光染色法檢測不同低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響。結果SRB染色結果顯示，濃度為5.900 00 nmol/L的OA對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖仍有抑制作用，隨著OA濃度逐漸下降則出現促肝癌細胞增殖，但更低濃度組促增殖作用逐漸降低，濃度達到0.014 75 nmol/L時無促增殖作用。PCNA表達變化趨勢與SRB結果一致。結論低濃度OA促進人肝癌細胞SMMC-7721的增殖。

癌，肝細胞；細胞增殖；增殖細胞核抗原；岡田酸

1981年Tachibana首次從岡田軟海綿（Halichondria okadai）和隱海綿（H.melanodocia）中分離得到了具有特殊構造的聚醚（polyether）化合物——岡田軟海綿酸，即岡田酸（OA）［1］。研究顯示，OA作為參與調節細胞代謝、分化及凋亡、信號通路等一系列生理病理事件的經典蛋白磷酸酶2A（PP2A）的抑制劑，通過抑制PP2A的活性使磷酸化蛋白底物迅速累積，因此被認為是一種促癌物［2］。但文獻顯示，10 ng/mL的OA對人肝癌細胞BEL-7402的增殖有顯著抑制作用［3］，作者進行的前期體外實驗同樣發現OA對人肝癌細胞SMMC-7721的生長有抑制作用，其半數抑制濃度（IC50）為59 nmol/L。這些研究結果均與OA作為一種公認的促癌物相矛盾。因此推測，OA作用于體外培養的腫瘤細胞，是否是由于濃度因素而直接影響腫瘤細胞的生長，而其抑制作用的發生可能是由于OA濃度較高所致。那么，低濃度下是否會出現相反的變化。為了解決這一疑問，本實驗擬探討低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721生長的影響，為下一步研究OA的促癌機制提供有效的藥物濃度數據參考和體外實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物OA購自Sigma公司，用DMSO溶解，配制濃度為10 μmol/L的儲備液，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。

1.1.2肝癌細胞株人肝癌細胞SMMC-7721購于中國科學院細胞庫。

1.1.3試劑RPMI-1640培養基（美國Gibco公司），南美胎牛血清、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），磺酰羅丹明（SRB，美國Sigma公司），牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國Sigma公司），增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（Abcam公司），Cy3標記山羊抗小鼠二抗（美國Sigma公司）。

1.1.4主要儀器3131型CO2培養箱、Multiskan spectrum全波長酶標儀（美國Thermo公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2方法

1.2.1人肝癌細胞SMMC-7721的培養參照文獻［4］進行細胞培養。

1.2.2SRB染色法取100 μL細胞懸液（4 000個細胞）平行接種于2塊96孔板，一塊為對照板（T0），另一塊為實驗板。于CO2培養箱中培養20 h后，將對照板取出，用預冷的50%三氯乙酸（TCA）固定待測，實驗板中以加入不同低濃度OA（終濃度分別為5.900 00、0.59000、0.059 00、0.029 50、0.014 75 nmol/L）為實驗組（T），同時設空白對照組（C），每組5個復孔，繼續培養24 h后取出培養板，參照文獻［5］進行SRB染色，最后在酶標儀上選擇565 nm波長測吸光度（OD）值。按照公式計算生長增殖率。

1.2.3免疫熒光染色法檢測人肝癌細胞SMMC-7721 PCNA的表達細胞懸液接種于48孔板中（細胞濃度為1×105個/mL，每孔100 μL），37℃、5%CO2培養20 h后棄培養基，再加入不同低濃度的OA（終濃度分別為5.900 00、0.590 00、0.059 00、0.029 50 nmol/L），空白對照組加等量的培養基，各組設3個平行孔。培養24 h后棄培養基，PBS清洗，每孔加入4%多聚甲醛固定30 min，以 0.1%Triton X-100室溫孵育 15 min，3%過氧化氫（H2O2）滅活內源過氧化物酶后，PBS清洗3次后加5% BSA 37℃封閉1 h，PBS清洗。滴加小鼠抗人PCNA抗體（1∶300）4℃孵育過夜（以PBS代替一抗作為陰性對照），PBS清洗3次，加入Cy3標記山羊抗小鼠二抗（1∶800）37℃孵育1 h，PBS清洗3次，DAPI染色30 min，PBS清洗后，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。同時采用Image2XJ軟件分析各組細胞細胞核中PCNA的表達量。

1.2.4染色觀察為檢測PCNA在人肝癌細胞SMMC-7721中的細胞定位，首先用免疫熒光染色對人肝癌細胞SMMC-7721內的PCNA進行定位分析，同時用DAPI對細胞核進行染色定位（藍色熒光）。

1.3統計學處理應用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1不同低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721的促增殖作用與空白對照組比較，濃度為5.900 0 nmol/L的OA對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖仍有抑制作用，但隨著OA濃度逐漸下降則出現促肝癌細胞增殖，OA濃度為0.590 00 nmol/L時對肝癌細胞有明顯的促增殖作用，隨著濃度的下降促進肝癌細胞增殖作用愈加明顯，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。但更低濃度組促增殖作用逐漸降低，濃度達到0.014 75 nmol/L時無促增殖作用。見圖1。

圖1　不同低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721增殖作用的影響

2.2不同低濃度 OA對人肝癌細胞 SMMC-7721中PCNA表達的影響

2.2.1染色觀察PCNA在人肝癌細胞SMMC-7721的細胞核及細胞質內均有表達（紅色熒光），以細胞核表達為主。其PCNA在細胞核中的表達變化趨勢與SRB結果一致。見圖2。

2.2.2細胞核中PCNA相對表達量測定與空白對照組比較，OA濃度為5.900 00 nmol/L時肝癌細胞的PC NA表達顯著降低，隨著OA濃度逐漸下降PCNA表達呈上升趨勢，OA濃度為0.590 00 nmol/L時肝癌細胞的PCNA表達增加顯著，隨著濃度的下降PCNA表達增加更明顯，但隨著濃度進一步下降（OA濃度為0.02950nmol/L）肝癌細胞的PCNA表達又呈下降趨勢。見圖3。

圖3　不同低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721中PCNA表達的影響

3　討　論

OA作為一種公認的促癌物，能夠促進腫瘤形成，在極低濃度范圍就可對人類健康造成潛在的威脅［6］。國外學者研究發現，OA對PP2A有較強的選擇性，并且能夠促進小鼠體內腫瘤的生長［7］。但有研究結果提示，在體外水平OA能抑制腫瘤細胞的生長［3，8］，這與作者前期的實驗結果相似。以上體外的研究結果與OA作為一種公認的促癌物相矛盾。課題組推測可能是較高濃度的OA抑制了腫瘤細胞的生長，降低其濃度則有可能出現相反的變化。因此本實驗首先采用SRB法檢測不同低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721的促增殖作用。結果顯示，濃度為5.900 00 nmol/L的OA對人肝癌細胞SMMC-7721的增殖仍有抑制作用，隨著OA濃度逐漸下降則出現促肝癌細胞增殖，但更低濃度組促增殖作用逐漸降低，濃度達到0.014 75 nmol/L時無促增殖作用，提示低濃度OA促進人肝癌細胞SMMC-7721的增殖。在此基礎上，應用免疫熒光染色法檢測不同低濃度OA對人肝癌細胞SMMC-7721中PCNA表達的影響。PCNA參與調節DNA的合成［9］，其表達水平和增殖細胞中DNA復制的活躍程度基本保持一致，通常被作為一項評估細胞增殖活性的重要指標。有實驗證明，PCNA在細胞核內陽性表達的高低與細胞增殖活性密切相關。實驗發現，細胞核中PCNA相對表達量的變化趨勢與SRB結果一致，再次印證了低濃度OA對腫瘤細胞的促增殖作用。為下一步研究OA的促癌機制提供有效的藥物濃度數據參考和體外實驗依據。

以往研究認為，PCNA主要表達于細胞核，但是本實驗結果顯示，PCNA不僅定位于細胞核，在細胞質中也有表達，并且隨著OA的濃度降低，細胞質中的表達量也呈現上升趨勢。研究表明，在某些腫瘤細胞中，PCNA部分在細胞質表達并與多種腫瘤相關蛋白結合，提示細胞質中的PCNA可能參與了腫瘤的某些病理過程［10］。本實驗提示，OA可能在細胞中對PCNA重新定位，介導PCNA在細胞質中參加其他腫瘤生物學行為，這與OA的促癌作用是否相關有待進一步研究。

［1］Tachibana K，Scheuer PJ，Tsukitani Y，et al.Okadaic acid，a cytotoxic polyether from two marine sponges of the genus Halichondria［J］.J Am Chem Soc，1981，103（9）：2469-2471.

［2］Rajesh D，Schell K，Verma AK.Ras mutation，irrespective of cell type and p53 status，determines a cell′s destiny to undergo apoptosis by okadaic acid，an inhibitor of protein phosphatase 1 and 2A［J］.Mol Pharmacol，1999，56（3）：515-525.

［3］陳洋，顏天，于仁成，等.OA對人肝細胞HL-7702和肝癌細胞Bel-7402增殖的影響和對細胞凋亡的誘導作用研究［J］.中山大學學報：自然科學版，2008，47（5）：86-92.

［4］晏容，劉云，朱欣婷，等.不同斑蝥素類物質對人肝癌細胞HepG2增殖作用的研究［J］.現代醫藥衛生，2015，31（21）：3209-3211.

［5］Vichai V，Kirtikara K.Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening［J］.Nat Protoc，2006，1（3）：1112-1116.

［6］Creppy EE，Traoré A，Baudrimont I，et al.Recent advances in the study of epigenetic effects induced by the phycotoxin okadaic acid［J］.Toxicology，2002，181/182：433-439.

［7］Suganuma M，Fujiki H，Suguri H，et al.Okadaic acid：an additional nonphorbol-12-tetradecanoate-13-acetate-type tumor promoter［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1988，85（6）：1768-1771.

［8］李偉，陶敏，陳凱，等.蛋白磷酸酶2A抑制劑對胰腺癌細胞絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活作用及對細胞生長的影響［J］.中華實驗外科雜志，2013，30（1）：170.

［9］李新星，王堅.PCNA與Caspase-3在膽囊癌組織中的表達及其臨床意義［J］.肝膽胰外科雜志，2012，24（1）：14-17.

［10］徐曉恒.增殖細胞核抗原胞質表達對乳腺癌細胞自噬調控作用的研究［D］.長春：吉林大學，2015.

Effect of low concentration of Okadaic acid on growth of human hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721*

Zou Qian-qian1，Yan Rong1，3，Liu Yun2，3，Liu Liu1，Li Xiaofei1，3△（1.College of Basic Medicine，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Medical and Biological Research Center，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China）

ObjectiveTo explore the effect of low concentration of Okadaic acid（OA）on the growth of hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721.Methods（1）The sulforhodamine B（SRB）staining method was employed to detect the promoting proliferation effect of OA with different low concentrations（5.900 00，0.590 00，0.059 00，0.029 50，0.014 75 nmol/L）on hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 in vitro.（2）The immunofluorescence staining method was used to detect the effect of OA with different low concentrations on the expression of SMMC-7721 proliferating cell nuclear antigen（PCNA）.ResultsThe SRB results showed that when the OA concentration was 5.900 00 nmol/L，it still had inhibiting effect on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721.However，as the gradual decline of OA concentration，it had a promotion effect on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells，but its proliferation promotion effect at even lower concentration was gradually decreased. When the concentration reached 0.014 75 nmol/L，there was no promotion effect on proliferation.The expression change tendency of PCNA was consistent with the results of SRB.ConclusionLow concentration of OA can promote hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721 proliferation.

Carcinoma，hepatocellular；Cell proliferation；Proliferating cell nuclear antigen；Okadaic acid

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.003

A

1009-5519（2016）05-0645-03

國家自然科學基金項目（81560669）；貴州省教育廳特色重點實驗室建設項目（黔教合KY字［2014］212）。

鄒倩倩（1987-），在讀碩士研究生，主要從事昆蟲資源開發與利用方面的研究。

△，E-mail：lixiaofei35@sohu.com。

（2015-12-21）