酒續斷對骨質疏松型大鼠OPG/RANK/RANKL軸系統的調控研究*

陶益，陳西，任玉超，蔡寶昌（南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023）

酒續斷對骨質疏松型大鼠OPG/RANK/RANKL軸系統的調控研究*

陶益，陳西，任玉超，蔡寶昌
（南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023）

目的比較生、酒續斷灌胃給藥對骨質疏松大鼠骨保護素（OPG）/細胞核因子-κB受體活化因子（RANK）/RANK配體（RANKL）軸的調控差異。方法將30只購于上海杰思捷實驗動物有限公司的SPF級SD大鼠通過去勢法造成骨質疏松大鼠模型，隨機分為正常組、假手術組、模型組、雌二醇組、生續斷組和酒續斷組，每組5只，灌胃給藥12周后，麻醉主動脈取血，采用全自動生化分析儀對給藥12周后大鼠血清中鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶、骨鈣素4項基本指標進行分析，同時使用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清OPG、RANK和RANKL 3項骨代謝指標水平，并進行組間對比分析。結果與模型組比較，雌二醇組、生續斷組和酒續斷組大鼠的堿性磷酸酶、骨鈣素和RANKL水平均顯著降低，OPG和RANK水平均顯著升高，酒續斷組大鼠的Ca水平顯著降低，P水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與雌二醇組比較，生續斷組大鼠的堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著升高，酒續斷組大鼠的Ca水平顯著降低，P和骨鈣素水平顯著升高，生續斷組和酒續斷組大鼠的OPG和RANK水平均顯著降低，RANKL水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與生續斷組比較，酒續斷組大鼠的Ca、堿性磷酸酶、骨鈣素及RANKL水平均顯著降低，OPG和RANK水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論續斷對骨質疏松大鼠的治療作用與其調控OPG/RANK/RANKL軸有關，酒續斷的調控能力強于生續斷。

酒炙；續斷；骨保護素；Rank配體；骨質疏松；大鼠

【Abstract】Objective To compare the regulation difference of gavage administration of crude and wine-processed Dipsacus on OPG/RANK/RANKL axis in osteoporosis rat.Methods Thirty SPF grade SD rats purchased from the Shanghai Jiesijie Laboratory AnimalCo.，Ltd.were established the osteoporotic modelby the castrationmethod and randomly divided into the normal group，sham operation group，model group，estradiol group，crude Dipsacus group and wine-processed Dipsacus group，5 cases in each group.After 12 weeks of gavage administration，the ratswere anesthetized and aortic blood was collected.The basic biochemical indicators of serum Ca，P，alkaline phosphatase and osteocalcin were analyzed by adopting the automatic biochemical analyzer.Meanwhile，the 3 bonemetabolic indicators of serum OPG，RANK and RANKL levels were determined by using the ELISA method.Results Compared with the model group，the levels of alkaline phosphatase，osteocalcin and RANKL in the estradiolgroup，crude Dipsacus group and wine-processed Dipsacusgroup were significantly reduced，while the levelsofOPG and RANK were significantly increased，the Ca level in the wine-processed Dipsacus group was significantly reduced and the P level was increased，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with the estradiol group，the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in the crude Dipsacusgroup were significantly increased，whereas the Ca level in thewine-processed Dipsacus group was significantly reduced and the levels of P and osteocalcin were significantly increased，the levels of OPG and RANK in the crude and wine-processed Dipsacus groups were significantly reduced，while the RANKL levelwas significantly elevated，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）；compared with the crude Dipsacus group，the levels of Ca，alkaline phosphatase，osteocalcin and RANKL levels in thewine-processed Dipsacus group were significantly reduced，while the levels of OPG and RANK were significantly increased with statistical differences（P＜0.05）.Conclusion The curative effect of Dipsacus in treating osteoporosis rat is related with its regulating the OPG/RANK/RANKL axis.The regulation ability ofwine-processed Dipsacus is stronger than thatofcrude Dipsacus.

【Key words】Wine processing；Dipsacusasper；Osteoprotegerin；Rank ligand；Osteoporosis；Rats

骨質疏松癥屬于骨代謝性疾病，主要特征是骨量低于正常值和骨質微結構受破壞且變脆，容易導致骨折。隨著人口老齡化的加劇，老年骨質疏松癥患者持續增加，我國目前有3 500～4 000萬骨質疏松患者，女性占2/3，骨質疏松癥已經位居中老年人五大疾病患病率之首［1］。中藥在治療骨質疏松癥方面療效顯著，如續斷皂苷能夠顯著增加骨質疏松大鼠骨密度，增強骨強度［2］，但續斷治療骨質疏松癥的作用機制仍不清楚?，F代藥理學研究發現，骨保護素（OPG）、細胞核因子-κB受體活化因子（RANK）和RANK配體（RANKL）三者形成的局部調節體系在骨生長和骨重建中起著十分重要的調節作用［3-5］。作者推測續斷治療骨質疏松的作用可能與調控OPG/RANK/ RANKL軸有關。本文首先建立大鼠骨質疏松模型，然后灌胃給予生續斷和酒續斷水提取液，采用全自動生化分析儀對給藥12周后大鼠血清中鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶、骨鈣素4項基本指標進行分析，同時使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對血清中OPG、RANK和RANKL 3項骨代謝指標進行測定，比較生、酒續斷給藥后相關指標的差異性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物30只雌性SPF級SD大鼠購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（滬）2013-0006。通過去勢法將30只大鼠造成骨質疏松型大鼠模型，隨機分為六組，即正常組、假手術組、模型組、雌二醇組、生續斷組和酒續斷組，每組5只；大鼠體質量分別為（183.53±4.39）、（186.94±7.66）、（184.52±6.91）、（185.40±8.50）、（183.53±8.28）、（182.99±10.49）g，各組大鼠體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2藥物與試劑續斷藥材在四川收集，經南京中醫藥大學蔡寶昌教授鑒定為川續斷科植物川續斷（Dipsacusasperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai）的干燥根，黃酒購于紹興女兒紅釀酒有限公司，β-雌二醇購于阿拉丁試劑有限公司，ELISA試劑盒購于泉州科諾迪生物科技有限公司。按照《2015版中國藥典》要求對續斷進行炮制［6］，（1）生續斷：取原藥材，除去雜質，洗凈，潤透，切薄片，干燥，得生續斷備用；（2）酒續斷：取續斷片，加黃酒拌勻，每100千克續斷片用黃酒10 kg悶透，置炒制容器內，用文火加熱，炒至微帶黑色，取出，放涼，得酒續斷備用。稱取續斷生品及酒品各50 g，用8倍量純水加熱回流提取2次，每次2 h，合并2次提取液，濾過，倒入蒸發皿上濃縮至100mL，放置于4℃冰箱備用。

1.2方法大鼠適應性飼養7 d后，在無菌條件下，正常組不作處理，假手術組大鼠切除少量腹部脂肪，其余4組大鼠切除雙側卵巢。術后4周開始灌胃，生續斷組以生斷續1.35g/（kg·d）劑量灌胃；酒續斷組以酒斷續1.35 g/ （kg·d）劑量灌胃；雌二醇組以雌二醇25μg/（kg·d）灌胃給藥（雌二醇難溶于水，以0.5%羧甲基纖維素鈉助溶），每天1次；其他組給予相同體積的生理鹽水，持續12周。大鼠灌胃給藥12周后，禁食，麻醉，抽取腹主動脈血5 mL，經13 000 r/m離心10 min，吸取上清液，存放于-20℃冰箱待測。

1.2.1生化指標分析采用日立全自動生化分析儀對不同組別大鼠血清中Ca、P、堿性磷酸酶、骨鈣素4項指標進行測定［7］，并對結果進行統計分析。

1.2.2ELISA法檢測血清中OPG、RANK和RANKL水平將樣品血清稀釋、加樣，加酶標抗體，依次加入顯色劑、終止液，用酶標儀測量吸光度（OD值）。以標準物濃度和OD值計算出樣品水平，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際水平。

1.3統計學處理應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，各組間指標比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠常規生化指標結果比較與正常組比較，假手術組大鼠血清Ca、P、堿性磷酸酶水平無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05），而骨鈣素水平顯著升高，且模型組大鼠血清Ca水平顯著降低，堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著升高，雌二醇組、生續斷組和酒續斷組大鼠血清Ca水平顯著降低，血清P水平顯著升高，堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、生續斷組和酒續斷組大鼠的堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著降低，酒續斷組大鼠的Ca水平顯著降低，P水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與雌二醇組比較，生續斷組大鼠的堿性磷酸酶和骨鈣素顯著升高，酒續斷組Ca水平顯著降低，P和骨鈣素水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與生續斷組比較，酒續斷組大鼠的Ca、堿性磷酸酶和骨鈣素水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠血清中Ca、P、堿性磷酸酶和骨鈣素水平比較（±s，n=5）

表1　各組大鼠血清中Ca、P、堿性磷酸酶和骨鈣素水平比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與雌二醇組比較，cP＜0.05；與生續斷組比較，dP＜0.05。

組別正常組假手術組模型組雌二醇組生續斷組酒續斷組2.54±0.06 2.47±0.05 2.41±0.04a2.42±0.07a2.42±0.06a2.32±0.02abcdCa （mmol/L）1.53±0.11 1.66±0.29 1.74±0.26 1.76±0.15a1.86±0.22a2.02±0.16abc39.25±3.69 39.00±8.25 61.67±4.89a42.75±2.63b49.20±3.70abc43.33±2.89bd6.56±0.14 7.72±0.28a68.29±2.91a14.69±1.78ab36.15±3.07abc26.08±2.21abcdP （mmol/L）堿性磷酸酶（U/L）骨鈣素（μg/L）

2.2各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較與正常組比較，假手術組大鼠血清OPG和RANK水平略有上升，RANKL水平略有降低，模型組大鼠血清OPG 和RANK水平顯著升高，RANKL水平顯著降低，雌二醇組、生續斷組和酒續斷組大鼠血清OPG和RANK水平顯著升高，RANKL水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，雌二醇組、生續斷組和酒續斷組OPG和RANK水平顯著上升，RANKL水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與雌二醇組比較，生續斷和酒續斷組OPG和RANK水平顯著降低，RANKL水平顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與生續斷組比較，酒續斷組OPG和RANK水平顯著升高，RANKL水平顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2　各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較（±s，n=5）

表2　各組大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與雌二醇組比較，cP＜0.05；與生續斷組比較，dP＜0.05。

169.23±12.93 235.35±12.86a336.86±14.11a959.79±30.55ab462.93±25.27abc544.01±26.32abcdOPG （ng/L）0.37±0.02 0.42±0.03a0.64±0.03a1.84±0.11ab0.89±0.07abc1.11±0.06abcd328.93±27.05 268.07±15.68a228.28±12.01a76.84±4.27ab171.24±13.82abc120.63±9.73abcdRANK （pmol/L）RANKL （μg/L）組別正常組假手術組模型組雌二醇組生續斷組酒續斷組

3　討論

續斷始載于《本經》，味苦、辛，微溫，歸肝、腎經。續斷的現代炮制方法主要有切片、酒炙、鹽制、炒制、麩制、炭制等，2015年版《中國藥典》收載3種在臨床上使用廣泛的飲片規格：生續斷片、酒續斷和鹽續斷［6］。續斷生品補肝腎、通血脈、強筋骨，多用于筋骨疼痛。酒續斷始載于《雷公炮炙論》，曰：“用酒浸一伏時，焙干用”，續斷酒炙可引藥向外行散，增強通血脈之功，多用于風濕痹痛，跌打損傷。續斷的主要化學成分為皂苷和酚酸類化合物，現代藥理學研究發現，續斷具有抗骨質疏松作用，皂苷類成分是其主要抗骨質疏松成分［7-11］。

骨質疏松癥是一種以骨量低下、骨微結構破壞、導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病。骨骼主要由膠原質和磷酸鈣組成，膠原質是一種形成軟組織的蛋白質，磷酸鈣則是一種增加骨骼強度和增加軟組織硬度的礦物質。常規與骨礦物質有關的生化檢查包括血清游離鈣、血清無機磷和血清鎂等［12］。本研究發現，生續斷和酒續斷灌胃給藥均能降低模型大鼠血鈣水平，提高大鼠血清無機磷水平，酒續斷灌胃給藥引起的變化幅度大于生續斷，說明生續斷和酒續斷灌胃給藥有利于血清中的游離鈣沉積形成骨骼。

骨生化標志物也是確定骨骼健康的一項重要指標［12］，如血清總堿性磷酸酶、骨鈣素和Ⅰ型前膠原羧基端前肽等是反映骨形成的生化指標。堿性磷酸酶在機體中的主要生理功能是在成骨過程中水解磷酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供必要的磷酸，同時水解焦磷酸鹽，解除其對骨鹽形成的抑制作用，有利于成骨作用。骨鈣素主要由成骨細胞合成并分泌，比較穩定，不受骨吸收因素的影響。通過血清骨鈣素可以了解成骨細胞，特別是新形成的成骨細胞的活動狀態。骨轉換加速是骨質疏松的一個特點，高骨轉換率可導致骨重吸收超過骨形成，增加骨折風險。骨鈣素水平隨骨更新率的變化而變化，骨更新率越快，骨鈣素水平越高，反之，則降低。原發性骨質疏松和絕經后骨質疏松是高轉換型的，所以骨鈣素明顯升高；老年性骨質疏松癥是低轉換型的，因而骨鈣素升高不明顯。本研究發現，生、酒續斷灌胃給藥均能降低模型組大鼠血清堿性磷酸酶活性，降低血清骨鈣素水平，說明生、酒續斷灌胃可以降低骨轉換率，減少骨質重吸收，且酒續斷的作用更強。

骨骼的形態發生和重建包括2個對立統一的過程，即成骨細胞介導的骨基質合成過程和破骨細胞介導的骨吸收過程。OPG、RANK和RANKL形成的局部調節體系，在骨生長、發育及骨構塑和骨重建中起著十分重要的作用［4］。RANKL是破骨細胞分化所必需的細胞因子，促進破骨細胞前體細胞分化，誘導破骨細胞生成；RANK是RANKL的受體，二者結合后參與破骨細胞的分化，促進骨質的吸收；OPG主要由成骨細胞分泌，特異性消除膜結合的可溶性RANKL抑制破骨細胞生成和成熟破骨細胞的活性。本研究發現，生、酒續斷灌胃給藥均能顯著提高模型大鼠血清OPG和RANK水平，降低RANKL水平，表明生、酒續斷均能抑制破骨細胞生成，抑制骨質吸收。

綜上所述，續斷能夠調控OPG/RANK/RANKL軸系統，促進成骨，抑制破骨，維持骨質疏松大鼠體內成骨和破骨活動的平衡，酒續斷的調控力度大于生續斷。

［1］張秋.現代醫學與傳統中醫結合防治骨質疏松新思路［J］.醫學信息，2014，27（6）：479-480.

［2］張琪，汪仙陽，馬博，等.復方續斷總皂苷鎮痛抗炎及預防骨質疏松癥的實驗研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（7）：1683-1684.

［3］孔祥鶴，牛銀波，李宇華，等.OPG/RANK/RANKL系統與骨質疏松研究最新進展［J］.生命科學研究，2011，15（1）：80-85.

［4］田虹，樊瑜波.OPG、RANK、RANKL的結構、作用機制和在骨疾病中的作用［J］.現代生物醫學進展，2010，10（20）：3963-3966.

［5］吳垠，趙承斌．OPG/RANK/RANKL系統與祖國傳統醫藥［J］.中國醫藥導報，2012，9（10）：134-136.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版）（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：329-330.

［7］蔣寧，楊芳，孫鑫，等．中醫不同治法對骨質疏松癥小鼠骨密度、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶影響的實驗研究［J］.中國骨質疏松雜志，2015，21（7）：789-791.

［8］楊延平，楊勇．續斷抗骨質疏松活性部位的篩選［J］.今日藥學，2012，22（6）：342-344.

［9］牛銀波，潘亞磊，李晨睿，等．續斷防治骨質疏松的研究進展［J］.中國藥理學通報，2013，29（7）：892-894.

［10］陶益，季德，蔡寶昌，等.續斷炮制工藝和炮制機理的研究進展［J］.中國藥房，2014，25（39）：3735-3738.

［11］陳小磚，李福安，曹亞飛．續斷對大鼠去卵巢骨質疏松的骨形態計量學研究［J］.中醫正骨，2004，16（5）：7-9.

［12］張萌萌．中國老年學學會骨質疏松委員會骨代謝生化指標臨床應用專家共識［J］.中國骨質疏松雜志，2014，20（11）：1263-1272.

Study on regulation of wine-processed Dipsacus on OPG/RANK/RANKL axis system in osteoporosis rats*

Tao Yi，Chen Xi，Ren Yuchao，Cai Baochang
（College ofPharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu 210023，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.003

A

1009-5519（2016）08-1127-03

科技部國家科技重大專項基金資助項目（2012ZX09304005）；江蘇省自然科學基金青年項目（BK20140963）。

陶益（1985-），助理研究員，主要從事中藥炮制學研究。

（2016-01-16）