基于核磁共振氫譜對健康種植體與健康天然牙齦溝液的代謝組學分析*

趙春艷，蘆帥△，鐘科，孫勇，熊萍，瞿紅云（.成都軍區機關醫院口腔科，四川成都600；.德陽市第二人民醫院口腔科，四川68000）

·論著·

基于核磁共振氫譜對健康種植體與健康天然牙齦溝液的代謝組學分析*

趙春艷1，蘆帥1△，鐘科1，孫勇1，熊萍2，瞿紅云1
（1.成都軍區機關醫院口腔科，四川成都610011；2.德陽市第二人民醫院口腔科，四川618000）

目的分析健康種植體與健康天然牙齦溝液（PISF）中的代謝產物，探尋二者PISF的成分構成。方法選取2010年5月至2012年5月于成都軍區機關醫院種植與修復臨床醫學專科中心行牙種植術、上部修復已完成、在口內行使功能超過1年的患者13例作為健康種植體組，同期選取健康天然牙13例作為健康天然牙組。采集兩組參與者口內健康種植體與健康天然牙周圍的PISF，使用核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測兩組PISF，運用主成分分析及正交信號校正-偏最小二乘法進行數據分析，比較健康種植體與健康天然牙周圍的PISF的成分。結果健康種植體組與健康天然牙組周圍組織的改良菌斑指數、牙齦出血指數、PISF指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），而牙周探診深度/種植體周探診深度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。1H-NMR圖中健康天然牙組較健康種植體組譜峰稍多，譜峰位置基本一致。主成分分析發現兩組沒有明顯差異，數據歸一化處理后進行偏最小二乘法分析，發現兩組數據相互交叉，不能區分開。結論健康種植體與健康天然牙周圍的PISF成分沒有明顯差異。

磁共振波譜學；牙種植體；牙齦縫液；主成分分析

【Abstract】Objective To analyze themetabolites of the peri-implantsulcular fluid（PISF）ofhealthy implantsand natural teeth and to explore their component constituent.Methods Thirteen cases of teeth implantation，completing upside repair and conducting oral function for over 1 year in the Institution Hospital of Chengdu Military Region from May 2010 to May 2012 were selected as the healthy implantation teeth group and contemporaneous 13 cases ofhealthy natural teeth were selected as the healthy natural teeth group.PISE around healthy implants and healthy teeth was collected and detected by using 1 hydrogen nu clearmagnetic resonance（1H-NMR）.The principal component analysis and OSC-PLSmethod were applied for the data analysis.The constituents of PISF were compared between the healthy implants and health natural teeth.Results There were no significant differences inmPLI，GBIand PISF indexes between the healthy dental implant group and the healthy natural teeth group （P＞0.05），and the difference in PD/PPDwas statistically different between them（P＜0.05）.In the1H-NMR spectroscopy，the spectrum peaks in the healthy natural teeth group were slightly more than those in the healthy implantgroup，the spectral peak positions were basically consistent.The principal componentanalysis found that there were no significant differences between the two groups.After the data normalization，the partial leastsquaremethod wasused to analyze the data.The data of the two groupswere found to be cross and not separated.Conclusion The components of PISF have no significant difference between healthy implantsand healthy natural teeth.

【Key words】Magnetic resonance spectroscopy；Dental implants；Gingival crevicular fluid；Principal component analysis

種植義齒與活動義齒、固定義齒相比，具有美觀、舒適、功能恢復好、不損傷鄰牙等優點，目前已成為缺牙修復最重要的方式之一。隨著種植技術的發展，種植體成功率越來越高。種植體成功的主要原因在于與周圍骨組織形成良好的骨整合現象，這是保證種植體能行使功能的首要條件。然而，種植體周圍組織與天然牙存在一定的差異，種植體與周圍骨組織直接結合，天然牙通過牙周膜與骨組織連接。齦溝液（PISF）可以反映牙周組織及種植體周圍組織的生理狀態，通過對PISF的研究，可以了解種植體與天然牙PISF成分的構成。

代謝組學是研究生物體內參與生物體新陳代謝，維持正常生理功能和生長發育代謝產物的有效方法［1］；其分析手段有核磁共振技術、高效液相色譜、氣相色譜、質譜及其聯用技術［1-2］，其中，核磁共振技術（nuclearmagnetic resonance，NMR）是最常用的分析技術之一。本實驗運用基于核磁共振氫譜（1H-NMR）的代謝組學技術研究健康種植體與健康天然牙PISF的成分構成。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料本研究選取2010年5月至2012年5月于成都軍區種植與修復臨床醫學專科中心行牙種植術（種植體為德國Bego骨水平種植體），上部修復已完成，在口內行使功能超過1年的患者13例（13顆種植牙）作為健康種植體組，其中男8例，女5例；年齡39～74歲，平均（55.7±8.3）歲。同期選取健康天然牙13例作為健康天然牙組，要求牙周組織健康。首選健康種植體的對側同名牙；若對側同名牙牙周有炎癥或缺失，則選擇對頜同名牙或健康鄰牙。兩組樣本來源相同，一般資料一樣；本研究通過醫院倫理委員會批準同意；所有患者均告知相關實驗內容并取得患者同意，均簽署知情同意書。

1.1.2納入標準全身健康狀況良好，無系統性疾病；口內部分牙缺失，種植修復已完成且在口內正常行使功能超過1年；一期手術均為潛入式，術后6個月行二期手術，安裝愈合基臺；無夜磨牙，咬合關系正常、種植義齒無咬合創傷者。

1.1.3排除標準吸煙、酗酒者；妊娠及哺乳期婦女；近3個月有牙周或種植牙周治療史；近3個月服用過抗生素或免疫制劑；常規牙科治療需抗生素預防者。

1.2方法

1.2.1研究方法采集參與者口內健康種植體與健康天然牙周圍的PISF。檢查臨床指標，濾紙條法采集PISF，濾紙條稱質量法測定PISF的量（mg）。使用Bruker600MHz核磁共振儀對樣品進行檢測，實驗溫度為298 K，脈沖序列為cpmgpr1d。設置采樣參數如下：循環等待時間為5 s，弛豫延遲時間為5 s，譜寬為12 335.526 Hz，采樣時間為2.656 4 s，采樣點數為32 768個，累加次數64次，預飽和方式抑制水峰。以D2O為溶劑，以溶劑峰為內標，獲得26個樣本的原始自由感應衰減信號。

將其導入MestReNova-6.1.1統計軟件，自動進行傅立葉轉換，調整相位，校正基線，以Acetate峰（1.9 ppm）作為全部譜圖化學位移的標準。對0.1～10.0 ppm的譜峰進行分析，以0.04 ppm單位的化學位移為分段積分單元。歸一化處理，導出數據，得到每個分段和對應的積分面積值的矩陣，得到1H-NMR圖和分段積分值。將保存的Excel表格中的數據輸入到SIMCA-P 11.5軟件進行多元統計分析。先進行主成分分析（principal components analysis，PCA）。PCA分析后對數據進行正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC），可以消除個體差異等干擾因素對組間差異的影響，之后進行偏最小二乘法（partial leastsquares，PLS）分析。

1.2.2檢測指標

1.2.2.1改良菌斑指數（mPLI）評分標準［3］0分為齦緣無菌斑；1分為無肉眼可見菌斑，只有探針尖端輕劃過牙面或種植體表面才能發現；2分為齦緣有肉眼可見菌斑；3分為大量菌斑和軟垢。

1.2.2.2牙齦出血指數（GBI）參考L?e［4］牙齦指數并適當修改，評分標準如下：0分為牙齦健康，牙齦顏色、點彩正常，探診無出血；1分為牙齦顏色、點彩正常，探診無出血，輕度充血；2分為牙齦充血呈紅色，點彩消失，探診出血；3分為牙齦明顯紅腫，指壓出血。

1.2.2.3牙周探診深度（PD）的測量以20～25 g的壓力探診待檢牙或種植體的唇（頰）側近中、中央、遠中，舌（腭）側近中、中央、遠中6個位點，記錄探診深度，取平均值作為本次的最終測量值。

1.2.2.4種植體周探診深度（PPD）的測量參考Lang等［5］和Heuer等［6］的方法，采用高分子刻度樹脂探針進行檢測。以20 g的壓力探診待檢牙或種植體唇（頰）側近中、中央、遠中，舌（腭）近中、中央、遠中6個位點，記錄探診深度，取平均值作為本次的最終測量值。

為避免臨床檢查對PISF質量的影響，先檢查待檢牙的mPLI，之后采集PISF，再依次檢查GBI、PD或PPD，最后進行影像學檢查。均采用高分子樹脂刻度探針進行探診。

1.3統計學處理1H-NMR分析運用SIMCA-P 11.5軟件進行主成分分析，對數據進行OSC后進行PLS分析。應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，mPLI、GBI、PPD、PISF等計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

1.3.2

2　結果

2.1兩組周圍組織的臨床指標分析健康種植體組與健康天然牙組周圍組織的mPLI、GBI、GCF/PISF指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），而PD/PPD比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。注：與健康天然牙組比較，aP＜0.05。

表1　健康天然牙及種植體周圍組織不同狀態的臨床指標（±s）

表1　健康天然牙及種植體周圍組織不同狀態的臨床指標（±s）

組別健康天然牙組健康種植體組0.95±0.63 0.93±0.73 0.19±0.10 0.19±0.10 0.97±0.29 1.74±0.35a10.48±0.59 10.53±0.60 mPLI（分）GBI（分）PD/PPD（mm）PISF（mg）

2.2兩組周圍PISF的核磁共振分析1H-NMR圖中健康種植體組與健康天然牙組譜峰的多少、高低有一定的差異，健康天然牙組譜峰稍多，譜峰位置基本一致。主成分分析發現兩組沒有明顯差異，兩組數據歸一化處理后進行PLS分析，發現兩組數據相互交叉，不能區分開，見圖1。

圖1　兩組周圍PISF 1H-NMR波譜圖

3　討論

代謝組學是一種研究生物體內參與生物體新陳代謝、維持正常生理功能和生長發育代謝產物的有效方法［7］；該技術廣泛應用于疾病的診斷與預測、微生物學的研究、藥物的代謝路徑及療效、營養學、環境學等領域。代謝組學的分析手段有核磁共振技術，高效液相色譜、氣相色譜、質譜及其聯用技術［1］。NMR是其中最常用的分析技術，其不破壞待檢樣品，無偏性，高通量和低檢測成本，樣品不需要復雜預處理，便可檢測大多數物質［8］。基于NMR的代謝組學技術廣泛應用于疾病診斷、藥理研究和臨床前毒理等方面發揮了重要作用［9-10］。

種植體周圍軟組織結構類似于天然牙牙周組織，種植體周圍的結合上皮及齦溝上皮圍繞種植體形成軟組織環形封閉，在結合上皮上方，齦溝上皮與植體之間形成類似于牙齦溝的解剖結構［11］。PISF是由溝內上皮下結締組織中的物質滲透到齦溝內形成的，其成分主要來自牙周組織、血清及牙菌斑中的微生物，包括各種電解質、葡萄糖、蛋白質、酶、補體-抗體系統等，也含有少量白細胞及脫落上皮細胞等［12］。PISF是一種組織滲出液，其流出量與牙周組織的炎癥程度成正比［13］，PISF的流量和成分可以反映牙周組織的健康狀況［14］。在組織學形態及生化特征上，種植體周圍齦溝與天然牙齦溝均有相似的地方；種植體周圍PISF也含有參與炎性反應、免疫反應的各種因子和酶。本研究將健康種植體和健康天然牙PISF量進行比較，結果顯示二者無顯著差異。這與眾多學者的研究結果一致［15-16］，證明健康種植體和健康天然牙分泌的PISF量相近。

PISF主要來自血清及牙菌斑中的細菌。牙菌斑在牙周堆積，產生一些大分子產物，這些產物擴散并聚集在牙齦上皮基底膜處，產生持續的滲透梯度，使組織液滲出至齦溝內，形成PISF［12］。研究表明隨著牙菌斑堆積時間延長，PISF的量會增多［16］。牙齦健康者牙周僅有少量牙菌斑，所以PISF的量也極少。有研究證實，健康種植體及健康天然牙周圍的齦下微生物群落組成及結構相似，分泌到PISF中的成分相似。純鈦種植體及其上部結構生物安全性和生物反應性好，對周圍組織無毒、無刺激、不致敏、不產生免疫排斥，能與牙周組織保持良好的反應性和結合性，保持穩定的狀態。純鈦表面能吸附清蛋白、纖維粘連蛋白、膠原酶等蛋白分子，促進細胞附著；同時也支持組織細胞的生長、增殖和分化，不會對周圍組織的代謝形成干擾［16］。健康天然牙及健康種植體周圍PISF的成分相似。

［1］李兵，牛文輝，李淼，等.1H-NMR法用于口腔念珠菌菌種鑒定及代謝產物分析［J］.現代口腔醫學雜志，2013，27（3）：154-158.

［2］SanzM，Chapple IL，WorkingGroup 4 of the VIIIEuropeanWorkshop on Periodontology.Clinical research on peri-implant diseases：consensus reportofWorkingGroup 4［J］.JClin Periodontol，2012，39Suppl12：202-206.

［3］巢永，梁星.種植義齒學［M］.北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1999：152-156.

［4］L?e H.TheGingival Index，the Plaque Index and the Retention Index Systems［J］.JPeriodontol，1967，38（6）：610-616.

［5］Lang NP，Wetzel AC，Stich H，etal.Histologic probe penetration in healthy and inflamed peri-implant tissues［J］.Clin Oral Implants Res，1994，5（4）：191-201.

［6］HeuerW，Kettenring A，Stumpp SN，et al.Metagenomic analysis of the peri-implant and periodontalmicroflora in patients with clinical signs of gingivitisormucositis［J］.Clin Oral Investig，2012，16（3）：843.

［7］李明云，郭強，周學東，等.口腔常見放線菌代謝組學鑒定的初步研究［J］.華西口腔醫學雜志，2009，27（4）：443-446.

［8］SeliE，SakkasD，ScottR，etal.Noninvasivemetabolomic profilingofembryo culturemedia using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization［J］.FertilSteril，2007，88（5）：1350-1357.

［9］Bringaud F，Biran M，Millerioux Y，etal.Combining reverse geneticsand NMR-basedmetabolomicsunravels trypanosome-specificmetabolic pathways［J］.MolMicrobiol，2015，96（5）：917-926.

［10］宿玉成.現代口腔種植學［M］.北京：人民衛生出版社，2004：28-35.

［11］劉紅紅.種植體及天然牙周齦溝液內白介素-2水平的研究及其與種植體與天然牙周狀況的關系［D］.合肥：安徽醫科大學，2009.

［12］AlRowisR，AlMoharib HS，AlMubarak A，etal.Oral fluid-based biomarkers in periodontal disease-part2.Gingival crevicular fluid［J］.Int Oral Health，2014，6（5）：126-135.

［13］Toker H，Marakoglu I，PoyrazO.Effectofmeloxicam on gingival crevicular fluid IL-1betaand IL1 receptorantagonist levels in subjectswith chronic periodontitis，and itseffectson clinicalparameters［J］.Clin Oral Investig，2006，10（4）：305-310.

［14］張漪.種植體周圍齦溝液中SOD、GP-x、MDA水平的初步研究［D］.重慶：重慶醫科大學，2014.

［15］陳一.牙種植術后種植體周圍齦下微生物群落的動態研究［D］.瀘州：瀘州醫學院，2012.

［16］趙晶妹.口腔純鈦種植體表面改性及其生物性能研究［D］.上海：上海交通大學，2013.

M etabonom ics analysis of gingival sulcus fluid of healthy imp lant and healthy natural teeth based on nuclear magnetic resonancehydrogen spectroscopy*

ZhaoChunyan1，Lu Shuai1△，Zhong Ke1，Sun Yong1，Xiong Ping2，Qu Hongyun1（1.Department of Stomatology，Institution HospitalofChengdu Military Region，Chengdu，Sichuan 610011，China；2.Department of Stomatology，DeyangMunicipalSecond People′sHospital，Sichuan 618000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.004

A

1009-5519（2016）08-1130-03

成都軍區面上課題（C14051）。

趙春艷（1988-），碩士研究生，主要從事口腔種植修復研究。

△，E-mail：lushuai@163.com。

（2016-01-28）