多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥表型及分子流行病學調查研究*

宋敏，向成玉，丁銀環，楊葵，吳澤才，林雁，劉靳波（西南醫科大學附屬醫院檢驗科，四川瀘州646000）

·論著·

多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥表型及分子流行病學調查研究*

宋敏，向成玉，丁銀環，楊葵，吳澤才，林雁，劉靳波△
（西南醫科大學附屬醫院檢驗科，四川瀘州646000）

目的探討該院多藥耐藥銅綠假單胞菌（PAE）的耐藥表型及其分子流行病學特征，為醫院內感染監控和制訂感染控制措施提供科學依據。方法收集該院2012年9月至2013年2月臨床分離的49株多藥耐藥PAE，采用MicroScan WalkAway 96SI全自動微生物鑒定/藥敏測試系統鑒定菌株并獲得對15種抗菌藥物藥敏結果。利用基因外重復回文序列-聚合酶鏈反應（REP-PCR）對PAE進行分子分型。結果49株多藥耐藥PAE，對亞胺培南的耐藥率最高，為79.6%；對慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、加替沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸的耐藥率在38.8%～65.3%。49株PAE的遺傳相似性為0.70～1.00，經REP-PCR技術，將49株多藥耐藥PAE分為4型及9個亞型。結論該院多藥耐藥PAE耐藥嚴重并存在克隆傳播流行，及時實施醫院內感染的防控策略，能有效預防多藥耐藥PAE的暴發和流行。

假單胞菌，銅綠；聚合酶鏈反應；藥物耐受性；交叉感染

【Abstract】Objective To investigate the drug resistance phenotype andmoleculare pidemiology characteristics of multidrug resistant pseudomonas aeruginosa（PAE）to provide the scientific basis for controlling the nosocomial infection and formulating the infection controlmea sures.Methods Forty-nine strains of multi-drug resistantPAE in our hospital from September 2012 to February 2013 were collected and identified by the Micro Scan Walk Away 96 SIautomaticmicrobial identification/susceptibility testsystem.The susceptibility results of PAE to 15 kinds ofantibacterial drugswere obtained at the same time.Finally，PAE was performed the molecular typing by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction（REP-PCR）.Results Forty-nine strains of multi-drug resistant PAE had the highest resistance to imipenem（79.6%）；which to gentamicin，amikacin，tobramycin，ceftazidime，ceftriaxone，cefotaxime，cefepime，aztreonam，gatifloxacin，cipr of loxacin，lev of loxacin，piperacillin，piperacillin/me thimazole，ticarcillin/clavulanate was 38.8%-65.3%.Forty-nine isolates of PAE had the genetic similarity of0.70-1.00 and were divided into 4 typesand 9 subtypesby using REP-PCR.Conclusion Multi-drug resistantPAE has serious drug-resistance and the cloned spread exists in our hospital，the timely implementation of hospital infection prevention and control strategies can effectively prevent the outbreaksand prevalence of multi-drug resistant PAE.

【Key words】Pseudomonasaeruginosa；Polymerase chain reaction；Drug tolerance；Cross infection

銅綠假單胞菌（PAE）是引起人類感染的常見條件致病菌之一，可引起皮膚、黏膜、胃腸道、呼吸道等部位的感染，在醫院內感染中占了重要地位。2011年衛生部全國細菌耐藥監測網統計顯示，PAE臨床分離率在非發酵菌中位居第一［1］。近年來廣譜抗菌藥物的大量應用，PAE株耐藥情況日趨嚴峻，常呈現多藥耐藥，給臨床抗感染的治療帶來巨大挑戰［2］。本研究對本院臨床分離的多藥耐藥PAE耐藥表型和親緣關系進行研究，旨在實時監控醫院內感染，為臨床合理使用抗菌藥物及制訂醫院內感染控制措施提供科學依據。

1　材料與方法

1.1菌株來源收集本院2012年9月至2013年2月臨床分離的多藥耐藥PAE 49株。菌株分離于血液、痰、咽拭子、分泌物、尿液等標本，來自呼吸內科、ICU、燒傷科、神經外科、肝膽外科、兒科等科室。質控菌株ATCC 27853 PAE和ATCC25922大腸埃希菌。

1.2方法

1.2.1菌株的鑒定及藥敏采用MicroScanWalkAway 96SI全自動微生物鑒定/藥敏測試系統鑒定菌株并同時獲得對亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、加替沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸15種抗菌藥物的耐藥情況。

1.2.2細菌DNA的提取將凍存于-80℃的PAE株復蘇，采用煮沸法提取細菌DNA。即挑取適量菌落于懸濁于500μL蒸餾水中，100℃干浴10min，然后12 000 r/min離心5min，上清液即為DNA，應用核酸測定儀將DNA濃度調為10 ng/μL，-80℃冰箱保存備用。

1.2.3重復回文序列-聚合酶鏈反應（REP-PCR）擴增所用引物參照Versalovic等［3］即REP：5′-IIIGCGCCGICATCAGGC-3′，5′-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3′，優化后的反應體系：Taq DNA酶1.25U，10×Buffer2.5μL，dNTPs 200μmol/L，模板DNA 80 ng，P1、P2引物各1μmol/L，蒸餾水添加至25μL；優化后的擴增參數：95℃預變性3min；90℃變性30 s，45℃退火1min，65℃延伸8min為1個循環，循環次數35次；最后65℃延伸16min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上成像觀察，并攝像保存。

1.3數據分析采用Gel-Pro analyzer分析電泳條帶圖譜，將某條帶存在記為1，不存在記為0，構成原始數據矩陣。采用NTSYS 2.1e軟件用UPGMA法計算遺傳相似系數，進行SAHN聚類分析。

2　結果

2.1PAE對15種抗菌藥物的耐藥情況49株多藥耐藥PAE，對亞胺培南的耐藥率最高，為79.6%；對慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、加替沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸的耐藥率在38.8%～65.3%，見表1。

表1　49株PAE藥敏結果

2.2REP-PCR電泳指紋圖譜49株PAE的指紋條帶數在5～8條，部分菌株指紋圖譜見圖1。

圖1　REP-PCR擴增部分電泳圖

2.3REP-PCR聚類分析結果49株PAE的遺傳相似性為0.70～1.00，見圖2。49株PAE被分為A、B、C、D四大型，A型包括A1、A2亞型，A1亞型包括1、9、10號菌株，A2亞型包括5、8、49、11、13、16、37、21、33、48號菌株；B型包括B1、B2亞型，B1亞型包括2、23、47號菌株。B2亞型包括3、15、46、39號菌株；C型包括C1、C2亞型，C1亞型包括35號菌株，C2亞型包括41號菌株；D型包括D1、D2、D3亞型，D1亞型包括4號菌株，D2亞型包括17、31、26、30、40、32、18、19、28、25、27、29號菌株，D3亞型包括6、7、44、42、43、34、12、38、14、45、24、22、20、36號菌株。

圖2　REP-PCR聚類分析樹狀圖

3　討論

醫院內感染有較高的發病率與病死率，嚴重威脅著患者的預后和健康。醫院內感染的暴發或流行往往是由某種特定細菌引起，多重耐藥菌引起的醫院內感染日益嚴重，已成為醫院內感染控制領域的難題和焦點［4］。多藥耐藥PAE是醫院內感染常見的致病菌，其耐藥率高，耐藥機制復雜，易導致交叉感染，常引起醫院內感染的暴發與流行［5-7］。通過分子分型可以對特殊菌株引起的醫院內感染進行流行病學調查，證實臨床和流行病學的假設，還可用以對已確認的暴發流行進行傳染源追蹤，從而有效預防再次流行。因此，分子分型技術在確定感染病原菌、病原菌的親緣性、判定感染的暴發、尋找感染源等方面起著重要作用。隨著分子生物學技術的發展，特別是PCR技術的迅速發展，出現了一系列基于細菌DNA指紋圖譜的分子生物學分型方法。REP-PCR以其操作方便、費用低廉、不需要特殊儀器設備、不需要重復設計引物、分辨率高、重復性和穩定性較好、可以進行大樣本分析等優勢，便于各層次的醫院開展醫院內感染控制工作。

本研究49株多藥耐藥PAE對亞胺培南的耐藥率最高（79.6%），對頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、環丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南耐藥率均在50%以上，以上抗菌藥物考慮不作為首選藥物進行抗菌治療。對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、加替沙星、哌拉西林/甲巰咪唑、替卡西林/克拉維酸耐藥率在38.8%～46.9%，這幾種藥物可作為PAE經驗治療選擇藥物。隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛應用，多藥耐藥PAE藥株不斷增多，其耐藥性在不同地區或醫院之間存在差異［8］。因此，對本院PAE耐藥進行監測，為臨床第一時間經驗用藥提供指導和依據，對合理使用抗菌藥物，緩解抗菌藥物選擇性壓力，具有十分重要的意義。

REP-PCR基因分型將49株PAE分成4型和9個亞型，每個亞型內的菌株相似性系數為1，提示各亞型內的菌株可能是同一克隆菌株。查閱臨床資料發現，每個亞型內菌株大多是在同一病房或病區在同一時期分離所得，因此可以推斷這些克隆菌株多為醫院內感染。經回顧性調查分析，11、12號菌株分別于2012年10月5日、2012年10月7日從呼吸內科患者痰和腎病內科患者尿標本中獲得，REP-PCR分型結果顯示，11、12號菌株分屬于A型和D型，說明這2株菌屬于不同菌株，臨床資料和分型結果相符。23、26號菌株分別于2012年11月19日、2012年11月24日從ICU患者痰和分泌物中獲得，雖然這2株菌在同一病房中分離而得，但由于23、26號菌株分別屬于B型、D型，應視為不同分型的菌株。42、43、44號菌株，分別于2013年1月3日、2013年1月6日和2013年1月9日從ICU室患者痰和尿，以及呼吸內科患者分泌物分離而得，這些菌株可能來源于同一菌株的克隆流行。值得注意的是，這些克隆菌株可能在科室內部甚至科室之間存在克隆流行，應及時有效地切斷病原菌的醫院內感染途徑，遵守無菌技術操作規程，加強病房的感染管理，增強醫務人員手衛生意識，嚴格實施隔離措施，加強環境清潔和消毒工作等防控措施，從而避免病原菌在醫院內感染暴發流行。

［1］李耘，呂媛，鄭波.衛生部全國細菌耐藥監測網2011年度非發酵革蘭陰性桿菌耐藥監測［J］.中國臨床藥理學雜志，2012，28（12）：883-887.

［2］孫建芝，封建凱，李杰，等.醫院內感染多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥性分析及預防對策［J］.中國實驗診斷學，2013，17（8）：1391-1393.

［3］Versalovic J，Koeuth T，Lupski JR.Distribution of repetitiveDNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes［J］. Nucleic AcidsRes，1991，19（24）：6823-6831.

［4］Singh A，Goering RV，Simjee S，etal.Application ofmolecular techniques to the study of hospital infection［J］.Clin Microbiol Rev，2006，19（3）：512-530.

［5］Hirsch EB，Tam VH.Impactofmultidrug-resistant Pseudomona saeruginosa infection on patientoutcomes［J］.Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res，2010，10（4）：441-451.

［6］SaeidiN，Wong CK，Lo TM，etal.Engineeringmicrobes to senseand eradicate Pseudomona saeruginosa，ahuman pathogen［J］.Mol SystBiol，2011，7：521.

［7］祁虹，朱秋俠.ICU銅綠假單胞菌醫院感染暴發與控制措施［J］.中華醫院感染學雜志，2012，22（18）：4035-4036.

［8］鄧芳，張健，張世勇，等.多重耐藥銅綠假單胞菌感染的危險因素及耐藥性分析［J］.重慶醫學，2013，42（35）：4304-4306.

Survey and research on drug resistance phenotype and molecular epidem iology of multi-drug resistant pseudomonas

aeruginosa*

Song Min，Xiang Chengyu，Ding Yinhuan，Yang Kui，Wu Zecai，Lin Yan，Liu Jinbo△（Department of Clinical Lab-oratory，Affiliated Hospital of South westMedicalUniversity，Luzhou，Sichuan 646000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.006

A

1009-5519（2016）08-1135-03

瀘州市人民政府戰略合作科技項目（2013CDLZ-S15號）；瀘州醫學院科學研究資助項目（2013ZRQN034）。

宋敏（1985-），碩士研究生，主要從事臨床檢驗工作。

△，E-mail：lizonglin85@163.com。

（2016-01-17）