中草藥對產后子宮內膜炎病豬分離菌體外抑菌試驗

葛 凱左瑞華周夢雪　董雅婷張雅廷程楠楠

（1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽六安　237012；2.皖西學院健康養殖與動物疫病監測預警工程技術中心，安徽六安　237012）

中草藥對產后子宮內膜炎病豬分離菌體外抑菌試驗

葛 凱1，2左瑞華1，2周夢雪1董雅婷1張雅廷1程楠楠1

（1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽六安237012；2.皖西學院健康養殖與動物疫病監測預警工程技術中心，安徽六安237012）

選擇患有產后子宮內膜炎的母豬，采集子宮分泌物，分離出兩種菌株：大腸桿菌和鏈球菌。選擇五味子等15種中草藥，應用水提醇沉法制成質量濃度為1g/mL中草藥提取液，分別應用牛津杯法進行體外抑菌試驗；采用試管兩倍稀釋法測定了中草藥的最小抑菌濃度。結果顯示，15種中草藥中，五味子提取物對兩種細菌的抑菌效果較好，其強度均在中等以上，其余的中草藥抑菌效果不明顯；五味子對鏈球菌的最小抑菌濃度是15.65mg/m，對大腸桿菌是7.8mg/ml。通過此項研究，對中草藥五味子的開發利用研究提供參考。

豬；產后子宮內膜炎；大腸桿菌；鏈球菌；五味子

1 材料與方法

1.1病料采集和細菌分離

對某養豬場患有產后子宮內膜炎病豬應用輸精管采集子宮分泌物，注入滅菌的離心管中，4℃保存備用。

用接種環蘸取備用的病料，均勻劃線涂抹在牛肉膏蛋白胨培養基中，37℃恒溫培養24h。仔細觀察菌落，挑選數量較多、形態一致的菌落，轉接到另外一個培養基上，繼續37℃恒溫培養24h，即得到純化的菌種，取純化的單一菌落涂片，經革蘭氏染色鑒定方法，進行細菌初步鑒定。

1.2中草藥提取物

根據文獻資料，選擇15種中草藥：五味子、黃柏、金銀花、柴胡、蒲公英、大黃、連翹、苦參、黃苓、紅花、益母草、魚腥草、鐵皮石斛、丹參、大青葉，均購自中藥材市場。

應用水提醇沉法工藝制備中草藥提取液，取中草藥各100g，放在干凈的大燒杯中，加適量體積水浸泡24h，放在可調電爐上大火蒸煮，煮沸后，改為小火慢熬2h后，待冷卻后用干凈的雙層紗布過濾，收集濾液。將藥渣再次按前述方法制備濾液，將2次濾液合并，將濾液減壓濃縮至所需體積，按1：4的體積比加入無水乙醇，常溫靜置12h，真空抽濾去除沉淀，濾液經旋轉蒸發器減壓濃縮成100mL，獲得質量濃度為1g/mL的中草藥提取液，4℃保存備用。

1.3中草藥提取物體外抑菌試驗

設置2個西藥對照組：環丙沙星和頭孢曲松；15個中草藥組：五味子、黃柏、金銀花、柴胡、蒲公英、大黃、連翹、苦參、黃苓、紅花、益母草、魚腥草、鐵皮石斛、丹參、大青葉。

西藥組用藥敏紙片法進行抑菌試驗；中草藥組用牛津杯法：將純化的菌種均勻涂在牛肉膏蛋白胨培養基中。然后將培養基在底部劃分幾個均勻間隔區域并標記，將牛津杯按區域放置（注意牛津杯放置時要輕輕地按壓一下，防止藥液滲出），再分別注入先前準備好的中藥提取液均為200μl。最后，與西藥組共同置放在37℃恒溫培養24h，培養后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。此項試驗每種藥物設3個重復，取3次試驗的平均值。

抑菌效果判定標準：根據抑菌圈直徑大小判定如下：

抑菌圈：>20mm，記為：++++，抑菌效果：強；

抑菌圈：15-20mm，記為：+++，抑菌效果：較強；

抑菌圈：10-15mm，記為：++，抑菌效果：中；

抑菌圈：5-10mm，記為：+，抑菌效果：差；

抑菌圈：＜5mm，記為：-，抑菌效果：無效。

1.4中草藥提取物最小抑菌濃度（MIC）的測定

1.4.1菌液的制備

將分離純化的病菌，接種于牛肉膏蛋白胨培養基，37℃恒溫培養24h。挑取單一菌落，再接種于1%葡萄糖肉湯培養基中，37℃恒溫培養24h。用高壓滅菌生理鹽水進行稀釋，制成含菌落數量為105～106個/ml的菌懸液。

1.4.2最小抑菌濃度（MIC）的測定步驟

采用試管兩倍稀釋法測定MIC值，取10支大小一致試管順序編號：1～10號。每管均裝入5ml肉湯液體培養基，1號管中加入中草藥提取液5mL，渦旋混勻后吸取5ml轉移至2號管，以此類推，至8號管吸取5ml棄去，9號管為陽性對照，10號管為陰性對照。1～8號管的中草藥提取液濃度分別為500，250，125，62.5，31.25，15.65，7.8，3.9mg/ml，然后于1～8號管中分別接入菌懸液20μl，37℃恒溫培養24h。轉接到牛肉膏蛋白胨培養基上繼續培養，37℃，24h。最后觀察，無細菌生長的最小中藥濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.5數據分析

應用SPSS19.0分析軟件對中草藥的抑菌效果進行方差分析，然后對均值進行多重比較，結果采用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1產后子宮內膜炎病豬分離菌

本次試驗中，分離出多種細菌，其中菌落數量較多，最具優勢的菌種是鏈球菌和大腸桿菌，因此選用這兩種菌作為本次試驗菌。有的學者對從患有子宮內膜炎病豬體內分離獲得主要致病菌有葡萄球菌、綠膿桿菌等［7］，本次實驗沒有分離到綠膿桿菌，葡萄球菌很少。

2.2中草藥提取物的抑菌效果

15種中草藥提取液分別做了抑菌試驗，研究結果發現，五味子的抑菌效果非常明顯，與西藥效果相當。其它14種中草藥抑菌效果不明顯或者沒有效果，此處不再列出。見表1 、表2。

水提醇沉法制備工藝獲得中草藥提取物是一種混合物，五味子的有效成分可能適合這種提取方法，而有的中草藥可能沒有提出有效成分。隨著現代中藥制劑工藝發展，有學者采用醇提或有機溶劑萃取法，得到更加單一的成分，有利于中藥制劑的開發應用。同一種中草藥對不同細菌抑制效果也不一致，已有不少學者做了大量的研究報道，本試驗中五味子對兩種細菌的抑制效果不完全一樣，也表現出這個特點。

表1　五味子對鏈球菌的抑制效果

表2　五味子對大腸桿菌的抑制效果

2.3五味子最小抑菌濃度（MIC）

抑菌效果不明顯的中草藥提取液此項試驗省略。五味子對兩種分離菌的MIC值測定結果如表3所示。鏈球菌是15.65mg/ml，大腸桿菌是7.8mg/ml，五味子體外抑制大腸桿菌的強度明顯大于鏈球菌。此項試驗發現所分離的細菌種類不同，所需要的五味子最小抑菌濃度也是不一樣。有學者對五味子的有效抑菌濃度做了各方面的研究，五味子提取物對鏈球菌和大腸桿菌的MIC值有一定的差別，這與本實驗結果較一致。

五味子因富含多糖等多種化學成分，具有保肝益腎等功能，近年來成研究熱點，五味子的提取物能夠有效抑制豬源大腸桿菌和鏈球菌的生長，可能與五味子中具有多種抗菌成分有關。

表3　五味子抑制病原菌MlC值

3 小結

本項研究從眾多的中草藥中，發現五味子提取物能有效抑制產后子宮內膜炎病豬的主要分離菌：大腸桿菌和鏈球菌，而且抑制效果與抗生素相當。五味子的最小抑菌濃度分別是：鏈球菌是15.65mg/ml，大腸桿菌是7.8mg/ml。為了進一步弄清楚五味子的抗菌活性成分，下一步將對五味子主要有效成分進行分離提純并詳細分析鑒定，為中草藥制劑的精制和開發應用提供參考。

［1］葉健毅，趙學峰，陶家樹，等.母豬子宮內膜炎致病菌藥敏試驗及臨床治療［J］.動物醫學進展，2010，31（12）：172-176.

［2］李淑紅，王京仁，成鋼，等.8種中草藥對豬大腸桿菌的體外抑菌試驗［J］.廣東農業科學，2012，（22）：131 -135.

［3］張霞，艾啟俊，孫寶忠，等.中草藥提取物對沙門氏菌的抑菌效果研究［J］.食品工業科技，2010，（1）：88-90.

皖西學院動物科學專業校企合作實踐教學基地項目（2016WXXY30）。

葛凱（1977—），男，安徽壽縣人，碩士，講師，研究方向：中獸醫藥的研究與教學。