長鏈非編碼RNA MEG3在胃癌中的表達及其與預后的關(guān)系

孟菲菲　司君利　劉璐　崔京遠　亓玉琴　呂梅

長鏈非編碼RNA MEG3在胃癌中的表達及其與預后的關(guān)系

孟菲菲①司君利②劉璐③崔京遠④亓玉琴①呂梅①

目的：研究長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）在胃癌組織中的表達及其與預后的關(guān)系，并進一步探討MEG3與凋亡相關(guān)蛋白P53、鼠雙微基因2（murine double minute 2，MDM2）的相關(guān)性。方法：收集2012年9月至2013年6月青島大學附屬青島市市立醫(yī)院55例行手術(shù)治療的胃癌切除標本（包括癌組織及對應的遠端正常組織），實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測胃癌組織中MEG3的表達，并分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；應用免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測胃癌中P53、MDM2蛋白的表達水平，并分析其與MEG3的相關(guān)性。結(jié)果：lncRNA MEG3在胃癌組織的相對表達水平（7.98±0.19）低于所對應的正常組織（9.47±0.18，P＜0.05）；在胃癌組織（r=-0.627，P＜0.001）及遠端正常組織（r=-0.807，P＜0.001）中，P53與MDM2的表達呈負相關(guān)；P53與MEG3的表達呈正相關(guān)（r=0.591，P＜0.05），MDM2與MEG3的表達呈負相關(guān)（r=-0.346，P＜0.05）；MEG3高表達者較低表達者中位生存期明顯延長。結(jié)論：MEG3在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起抑癌基因的作用；MEG3與P53、MDM2在胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學機制上有重要聯(lián)系；檢測MEG3的表達水平對胃癌預后有潛在價值。

胃癌長鏈非編碼RNA母系表達基因3實時熒光定量PCR

胃癌是人體最常見的惡性腫瘤之一，位居消化道惡性腫瘤之首，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第2位［1］。由于癥狀缺乏特異性，因此其早期診斷困難，多數(shù)患者確診時已屬中晚期，且5年生存率仍處在較低水平。因此尋找有效的早期診斷、靶向治療及預后判斷標志物是目前研究的熱點。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，某些lncRNA在正常組織與相應的腫瘤組織中的表達呈顯著性差異，特異性表達的lncRNA可作為某些惡性腫瘤的預測因子［2］。母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是第1個被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的lncRNA。有報道提示，MEG3在多種人類組織中呈高表達，但在乳腺、肝、肺和前列腺等多種腫瘤細胞系表達為下降或缺失［3-5］。

本研究采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測MEG3在胃癌組織及正常組織中的表達，分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并進一步采用免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測胃癌及正常組織中P53、MDM2蛋白的表達，分析其與MEG3的相關(guān)性，旨在探索胃癌發(fā)病機制，并探討其作為胃癌靶向治療及預后判斷標志物的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料收集2012年9月至2013年6月于青島大學附屬青島市市立醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌切除標本55例，標本均經(jīng)病理科兩位以上的資深醫(yī)師證實，術(shù)前均未接受任何化療、放療或生物治療，且均進行局部淋巴結(jié)的清掃。55例標本均分為胃癌及配對的手術(shù)切緣正常組織（距離邊緣≥5 cm），將胃癌手術(shù)切除標本立即置于-80℃冰箱，用于qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應及Western blot檢測。隨訪時間從術(shù)后開始截至2015年12月31日。本研究經(jīng)過被研究對象或其家屬知情同意并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。1.1.2主要試劑和儀器cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購于美國BIOMIGA公司。P53抗體、MDM2抗體、GAPDH抗體均購于美國AbSci公司。羊抗兔IgG購于北京康為世紀生物科技有限公司。Light Cycler96熒光定量PCR儀購于瑞士羅氏公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR取100 mg的凍存組織置于研磨器中，加入1 mL Trizol，將研磨器放置于液氮中磨成粉末狀，靜置5 min后提取總RNA。取5 μL總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測其完整性。逆轉(zhuǎn)錄按照BIOMIGA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镉缮虾Ｉど锕こ碳夹g(shù)服務有限公司合成。qRT-PCR按照美國BIOMIGA公司的SYBR GreenⅠ說明書配制反應體系。取cDNA進行qRT-PCR。條件如下：95℃預變性10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個復孔。qRT-PCR引物序列如下［6］，MEG3：F：5'-ATCATCCG TCCACCTCCTTGTCTTC-3'；R：5'-GTATGAGCATAG CAAAGGTCAG GGC-3'。GAPDH：F：5'-GAAGGTC GGAGTCAACGGATT-3'；R：5'-CGCTCCTGGAAGAT GGTGAT-3'。

1.2.2Western blot檢測取RIPA裂解液裂解組織，用勻漿器勻漿化處理，提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，取70 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉（4℃過夜），用P53兔多克隆抗體（1：200）、MDM2兔多克隆抗體（1：200）和GAPDH兔多克隆抗體（1：2 000）孵育，室溫搖床輕搖3 h，TBST洗滌3次（10 min/次）后，再分別用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1：2 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次（10 min/次），最后用化學發(fā)光顯色劑顯影并觀察結(jié)果。

1.2.3qRT-PCR結(jié)果判定△Ct=樣本Ct均值-內(nèi)參Ct均值，△△Ct=△Ct-（隨機陰性對照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參Ct均值），以2-△△Ct表示樣品中目的基因相對表達量。

1.2.4Western blot結(jié)果判定應用Quantity one圖像分析軟件對Western blot雜交條帶進行密度掃描，以P53及MDM2條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示各組織中P53及MDM2表達水平（灰度值為條帶密度值及面積值的乘積）。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用x±s表示，組間計量資料的比較采用t檢驗。MEG3與P53及MDM2表達的相關(guān)性應用Pearson進行相關(guān)性檢驗分析。生存分析采用Kaplan-Meier分析，組間比較采用Log rank法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測MEG3表達水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

55例患者中，胃癌組織中MEG3的表達水平（7.98±0.19）低于正常組織中的表達水平（9.47± 0.18），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對MEG3的表達水平與各臨床病理參數(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，MEG3與年齡、性別、腫瘤大小無相關(guān)性，與分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)（表1）。

2.2Western blot檢測P53、MDM2的表達水平及P53、MDM2相關(guān)性分析

應用Western blot法對胃癌及遠端正常組織中P53、MDM2蛋白的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)P53蛋白在胃癌組織中的表達水平低于正常組織，MDM2蛋白在胃癌組織中的表達水平高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01，表2，圖1）。采用Pearson對P53、MDM2蛋白的表達進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌及遠端正常組織中，兩種蛋白均呈負相關(guān)（r=-0.627，P＜0.001；r=-0.807，P＜0.001，圖2）。

表1　長鏈非編碼RNA MEG3的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1　Expression and clinicopathologic factors of lncRNA MEG3 in gastric cancer

表2　P53蛋白和MDM2蛋白的表達Table 2　Expression of protein P53 and MDM2

圖1　Western b1ot檢測部分樣本GAPDH、P53、MDM2蛋白表達Figure 1　Part of the expression of proteins GAPDH，P53，and MDM2 detected by Western blot

2.3MEG3的相對表達水平與P53、MDM2的相關(guān)性分析

采用Pearson對MEG3的相對表達水平分別與P53、MDM2進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，癌組織中MEG3的相對表達水平與P53呈正相關(guān)（r=0.591，P＜0.001）；而癌組織中MEG3的相對表達水平與MDM2呈負相關(guān)（r=-0.346，P=0.020）。

2.4MEG3表達水平與胃癌患者預后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier分析顯示，MEG3高表達組和低表達組的中位生存時間分別為33.7個月和25.6個月，MEG3低表達的胃癌患者的生存時間明顯低于高表達組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖3）。

圖2　P53和MDM2蛋白在不同胃組織中表達的相關(guān)性分析Figure 2　Correlation analysis of the expression of proteins P53 and MDM2 in different gastric tissues

圖3MEG3相關(guān)生存曲線Figure 3　MEG3-related survival curve

3　討論

隨著對人類基因組學研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)基因組序列中只有2%被翻譯成蛋白質(zhì)，而大部分被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA［7］。根據(jù)基因序列的長短，將非編碼RNA又分為小非編碼RNA和lncRNA。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子的總稱，其缺少完整的開放閱讀框，一度被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的噪音，不具有生物學功能。近年來研究表明，lncRNA與多種疾病密切相關(guān)，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、風濕免疫性疾病等［7］。

MEG3定位于染色體14q32.3，長約1.6 kb，是第1個被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的lncRNA。研究顯示，MEG3在腦、垂體、卵巢等多種正常組織中表達上調(diào)，但在多種腫瘤細胞系中表達降低甚至缺失［7-8］。過表達MEG3能抑制腫瘤細胞系的增殖，表明其扮演著一個抑癌基因的角色。目前研究證實，其抑癌作用與p53途徑有關(guān)，Lu等［8］發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）組織和細胞系中，MEG3表達均下降，通過上調(diào)MEG3表達后發(fā)現(xiàn)p53基因活性增高，提示MEG3可能通過P53途徑抑制NSCLC細胞的增殖，并促進其凋亡。已有報道證實，MEG3可通過多種途徑發(fā)揮抑癌作用，其機制與DNA甲基化、P53途徑、Rb途徑及影響血管生成均有關(guān)［9］。

本研究通過檢測MEG3基因的表達，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中的表達低于對應正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義，可推測其參與胃癌發(fā)生發(fā)展的過程。通過與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，MEG3的表達與分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，分化程度越差，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期越高，MEG3的表達水平越低，而與性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)，提示其與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。進一步采用Western blot法檢測胃癌及正常組織中P53及MDM2蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)P53在正常組織中的表達高于胃癌組織，而MDM2在胃癌組織中的表達相對較高，且在胃癌組織中及正常組織中，P53與MDM2的表達均呈負相關(guān)。對MEG3與P53及MDM2作相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)MEG3與P53呈正相關(guān)，與MDM2呈負相關(guān)。已有研究表明，P53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。P53的泛素化主要由MDM2調(diào)節(jié)，而MEG3可以下調(diào)MDM2的表達，使P53的水平保持相對穩(wěn)定，進而激活各種依賴P53的轉(zhuǎn)錄活動，達到抑制腫瘤發(fā)生的作用［10］。因此可以推測，MEG3可通過影響MDM2、P53蛋白的表達水平來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)，MEG3高水平表達者較低水平者生存時間長，說明MEG3可成為判斷預后的標志。

綜上所述，本研究采用qRT-PCR檢測MEG3在在胃癌中的表達及其與預后的關(guān)系，并結(jié)合臨床病理參數(shù)分析，結(jié)果表明其參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，并顯示MEG3可通過P53途徑影響細胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用，且MEG3的表達水平與預后明顯相關(guān)。因此，檢測MEG3有助于胃癌的診斷及對發(fā)現(xiàn)胃癌治療新靶點、評估預后提供新的思路。

［1］Catalano V，Labianca R，Beretta GD，et al.Gastric cancer［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2009，71（2）：127-164.

［2］ Gibb EA，Enfield KSS，Stewart GL，et al.Long non-coding RNAs are expressed in oral mucosa and altered in oral premalignant lesions ［J］.Oral Oncol，2011，47（11）：1055-1061.

［3］Zhou Y，Zhong Y，Wang Y，et al.Activation of p53 by MEG3 non-coding RNA［J］.J Biol Chem，2007，282（34）：24731-24742.

［4］ Braconi C，Kogure T，Valeri N，et al.microRNA-29 can regulate expression of the long non-coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer［J］.Oncogene，2011，30（47）：4750-4756.

［5］Zhang X，Gejman R，Mahta A，et al.Maternally expressed gene 3，an imprinted noncoding RNA gene，is associated with meningioma pathogenesis and progression［J］.Cancer Res，2010，70（6）：2350-2358. ［6］ Li Z，Li C，Liu C，et al.Expression of the long non-coding RNAs MEG3，HOTAIR，and MALAT-1 in non-functioning pituitary adenomas and their relationship to tumor behavior［J］.Pituitary，2015，18 （1）：42-47.

［7］Carninci P，Kasukawa T，Katayama S，et al.The transcriptional landscape of the mammalian genome［J］.Science，2005，309（5740）：1559-1563. ［8］ Lu KH，Li W，Liu XH，et al.Long non-coding RNA MEG3 inhibits NSCLC cells proliferation and induces apoptosis by affecting p53 expression［J］.BMC Cancer，2013，13（1）：1-11.

［9］ Balik V，Srovnal J，Sulla I，et al.MEG3：a novel long noncoding potentially tumour-suppressing RNA in meningiomas［J］.J Neurooncol，2013，112（1）：1-8.

［10］Brooks CL，Gu W.p53 regulation by ubiquitin［J］.FEBS Lett，2011，585（18）：2803-2809.

（2016-05-14收稿）

（2016-06-30修回）

（編輯：孫喜佳校對：武斌）

孟菲菲專業(yè)方向為消化道腫瘤的診斷及治療。

E-mail：17854299805@163.com

Expression of long non-coding RNA MEG3 and its relationship with the prognosis of human gastric cancer

Feifei MENG1，Junli SI2，Lu LIU3，Jingyuan CUI4，Yuqin QI1，Mei LV1
Correspondence to：Yuqin QI；E-mail：17854299805@163.com
1Department of Gastroenterology，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China；2Department of Emergency，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China；3State Key Laboratory of Marine Drugs Medical College，Ocean University of China，Qingdao 266000，China；4Department of General Surgery，Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University，Qingdao 266011，China

Objective：To investigate the expression of maternally expressed gene 3（MEG3），a long non-coding RNA gene，in gastric cancer tissues；determine the relationship of MEG3 with the prognosis of gastric cancer；and explore the relationship between MEG3 and apoptosis-associated protein P53 as well as murine double minute 2（MDM2）.Methods：Fifty-five consecutive patients with gastric cancer admitted to Qingdao Municipal Hospital for surgical treatment from September 2012 to June 2013 were included in this study. Gastric cancer and paired normal tissues were collected.The expression of MEG3 was tested through real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）.Western blot analysis was used to detect the expression of P53 and MDM2 in gastric cancer and evaluate their correlations with MEG3.Results：The expression of MEG3 decreased in cancer tissues（7.98±0.19）relative to the corresponding normal tissues（9.47±0.18）（P<0.05）.P53 and MDM2 showed negative relationships in the gastric cancer and normal tissues.A positive relationship was found between P53 and MEG3（r=0.591，P<0.05），whereas a negative relationship was found between MDM2 and MEG3（r=-0.346，P<0.05）.The median survival time was significantly prolonged in patients with high MEG3 expression compared with patients with low MEG3 expression.Conclusion：MEG3 exerts an inhibiting effect on the development of gastric cancer.MEG3，P53，and MDM2 may have important relationships in the biological mechanisms of gastric cancer development.Detecting the expression level of MEG3 may be useful for the prognosis of gastric cancer.

gastric cancer，long non-coding RNA，maternally expressed gene 3，real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase PCR

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.15.565

①青島大學附屬青島市市立醫(yī)院消化科（山東省青島市266011）；②青島大學附屬青島市市立醫(yī)院急診科；③中國海洋大學醫(yī)藥學院海洋藥物國家重點實驗室；④青島大學附屬青島市市立醫(yī)院普外科

亓玉琴17854299805@163.com