c-J un在肉雞腹水綜合征過程中肺動脈壁的表達變化及維拉帕米的干預研究

王建琳,喬健

(1.青島農業大學動物科技學院,山東青島266109;2.中國農業大學動物醫學院,北京海淀100193)

c-J un在肉雞腹水綜合征過程中肺動脈壁的表達變化及維拉帕米的干預研究

王建琳1,喬健2

(1.青島農業大學動物科技學院,山東青島266109;2.中國農業大學動物醫學院,北京海淀100193)

本試驗研究低溫誘發肉雞腹水綜合征過程中肺動脈壁c-Jun的表達,及阻斷鈣信號對肺動脈壁c-Jun表達的影響和對肉雞腹水綜合征發生的干預情況,為肉雞腹水綜合征發生機制的研究提供基礎.240只15日齡AA肉雞分為對照組、低溫組和維拉帕米組,15～50日齡每組隨機取6只測定右心肥大指數,取肺組織做石蠟組織切片進行c-Jun免疫組化染色分析.結果顯示,29～50日齡低溫組肉雞右心肥大指數較對照組和維拉帕米組明顯升高(P<0.05),低溫組肉雞20～50 μm、50～100 μm和100～200 μm肺小動脈c-Jun陽性指數分別從22、29日齡和29日齡開始到50日齡極顯著高于對照組和維拉帕米組(P<0.01).研究結果認為,低溫誘發肉雞腹水綜合征過程中不同直徑大小肺小動脈壁c-Jun表達明顯增強,阻斷鈣信號可明顯抑制肺小動脈壁c-Jun的表達和肉雞腹水綜合征的發生.

肉雞;腹水綜合征;肺小動脈;c-Jun;鈣信號

肉雞腹水綜合征(Ascites Syndrome,AS)是世界公認的肉雞三大疾病之一,給肉雞養殖業造成了巨大的經濟損失.Julian(1993)提出了肉雞AS的發生假說,即誘發因素-肺動脈高壓-右心肥大、衰竭-后腔靜脈回流受阻-肝臟淤血性營養不良-腹水發生[1].其中右心肥大是機體對肺動脈高壓的結構性代償,用右心肥大指數(右心室/全心室的重量,RV:TV)作為評價指標,來反映肺動脈高壓的形成、右心衰竭和肉雞AS的形成[2].

肉雞肺血管重塑是肺動脈高壓的形態學基礎,是肉雞AS的促發因素,以中膜增厚為其主要特征[3].肺動脈平滑肌細胞增殖是中膜增厚的直接原因,與原癌基因c-myc等的表達及鈣信號等密切相關[4-6],而有關肉雞AS發生過程中肺小動脈c-Jun蛋白的表達情況及鈣信號對其表達的影響等還未見報道.故本研究擬用免疫組織化學染色技術研究肉雞AS發生過程中肺動脈c-Jun蛋白表達的動態變化,及用鈣通道拮抗劑-維拉帕米阻斷鈣信號后肺動脈c-Jun蛋白的表達情況和右心肥大指數的變化情況,為肉雞AS發生機制的研究提供基礎.

1　材料與方法

240只14日齡AA肉仔雞隨機分為3組,為對照組(21±2)℃、低溫組(11±2)℃和維拉帕米組(11±2)℃(0.01%維拉帕米飲水),每組80只,每組每周隨機取6只翅靜脈注射戊巴比妥鈉處死測定右心肥大指數[7].

取右側肺組織下1/3固定、制備石蠟組織切片,應用多克隆抗體即用型免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)進行c-Jun免疫組織化學染色,并用蘇木素進行復染,顯微鏡下觀察結果.著色為棕色或黃色的為陽性細胞,其余為陰性細胞.結合圖像處理系統進行分析計算直徑為20～50 μm、50～100 μm和100～200 μm肺小動脈陽性細胞數所占總細胞數的百分比,作為c-Jun陽性指數(PI)[8].

用SPSS11.5軟件分析數據,數據表示為:平均數±標準差(Mean±SD),用Independenr-samples T Test方法分析組間差異性,P<0.05為差異顯著,P< 0.01為差異極顯著.

表1　各組肉雞右心肥大指數(RV:TV)的動態變化(n=6)

2　結果

2.1各組肉雞右心肥大指數(RV:TV)的動態變化低溫組肉雞RV:TV從29日齡開始到43日齡極顯著高于對照組(P<0.01),50日齡時顯著高于對照組(P<0.05),見表1.

2.2各組肉雞20～50 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-Jun)的變化環境低溫誘發肉雞肺血管重塑過程中,肺動脈血管平滑肌細胞c-Jun蛋白表達明顯增加.如表2所示,低溫組肉雞20-50 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-Jun)從22日齡開始到50日齡極顯著高于對照組(P<0.01).

表2　各組肉雞20～50 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-J un)的變化(n=6)

2.3各組肉雞50～100 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-Jun)的變化低溫組肉雞50～100 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-Jun)從29日齡開始到50日齡極顯著高于對照組(P<0.01),見表3.

2.4各組肉雞100～200 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-Ju)的變化低溫組肉雞100～200 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-Jun)從29日齡開始到50日齡極顯著高于對照組(P<0.01),見表4.

表3　各組肉雞50～100 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-J un)的變化(n=6)

表4　各組肉雞100～200 μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI(c-J un)變化(n=6)

3　討論

肺動脈平滑肌細胞增殖導致肺動脈中膜增厚,其增殖過程受到部分原癌基因的調控,研究報道c-fos和c-jun等原癌基因參與了人類和哺乳動物血管平滑肌細胞的增殖[9-10].增殖的血管平滑肌細胞胞漿內鈣離子濃度明顯升高,表明胞漿內鈣離子內流的增加是血管平滑肌細胞增殖所必須的[11].而胞漿內鈣離子濃度的升高也涉及到了原癌基因c-fos的激活與表達[12].本研究整個過程中,正常組肉雞不同直徑的肺小動脈c-Jun蛋白表達比較平穩,低溫組肉雞20～50 μm,50～100 μm,100～ 200 μm肺小動脈c-Jun蛋白分別于低溫處理一周(22日齡)開始增加,并且大部分一直處于持續增加狀態.與對照組相比,低溫組肉雞肺動脈c-Jun蛋白的表達于22日齡或29日齡極顯著升高,表明環境低溫明顯誘發了肉雞肺小動脈c-Jun蛋白的表達.維拉帕米組肉雞肺小動脈c-Jun蛋白的表達從22日齡或29日齡較低溫組極顯著降低,表明維拉帕米可明顯抑制低溫誘發的肉雞肺小動脈c-Jun蛋白的表達.結合前期維拉帕米可明顯抑制低溫誘發的肉雞肺動脈平滑肌細胞增殖的研究結果[6],認為鈣信號參與了低溫誘發的肉雞肺小動脈c-Jun蛋白的表達,參與了肺血管重塑.

肺血管重塑導致肺動脈管腔明顯縮小,從而增加肺血管阻力,促進了肺動脈壓升高.肺動脈壓升高將會使右心室壓力后負荷增加,故右心肥大是心臟對壓力負荷增加的形態學代償,故右心肥大指數可以直接反映右心肥大程度,也可以間接反映肺動脈壓的高低[13].本研究結果發現,肉雞低溫處理兩周后(29日齡)開始到試驗結束(50日齡)右心肥大指數顯著或極顯著高于對照組,而維拉帕米組肉雞右心肥大指數在29日齡到50日齡時顯著或極顯著低于低溫組,表明環境低溫誘發了肉雞右心肥大和肺動脈壓升高,維拉帕米明顯抑制了低溫誘發的肉雞右心肥大和肺動脈壓升高.研究結果表明,鈣信號參與了肉雞右心肥大的發生和肺動脈壓升高的過程.

綜合以上研究結果認為,低溫誘發肉雞AS過程中肺小動脈c-Jun蛋白表達明顯增強,阻斷鈣信號可抑制低溫誘發的肉雞肺小動脈c-Jun蛋白的過度表達和右心肥大的發生.

[1]Julian R J.Ascites in poultry[J].Avian Pathology,1993,23:419-454.

[2]Julian R J,McMillan I,Quinton M.The effect of cold and dietary energy on right ventricular ypertrophy,right ventricular failure and ascites in meat-type chickens[J].Avian Pathology,1989b, 18:675-684.

[3]王建琳,喬健,趙立紅,等.低溫誘發肉雞腹水綜合征發生過程中肺血管重塑與肺動脈高壓的關系[J].中國獸醫學報, 2007,27(6):874-878.

[4]王建琳,喬健,趙立紅,等.低溫誘發肉雞腹水綜合征過程中肺動脈平滑肌細胞增殖的變化[J].畜牧獸醫學報,2007,38 (3):276-281.

[5]王建琳,尹燕博.低溫誘發肉雞肺血管重塑過程中肺動脈平滑肌細胞c-Myc蛋白表達的變化[J].畜牧獸醫學報,2011,42 (1):99-103.

[6]王建琳,喬健,趙立紅,等.維拉帕米對環境低溫誘發肉雞肺動脈平滑肌細胞增殖的作用[J].中國獸醫雜志,2007,43 (12):29-30.

[7]Julian R T.The effect of increased sodium in the drinking water on right ventricle hypertrophy,right ventricular failure and ascites in broiler chickens[J].Avian Pathology,1987,16:61-71.

[8]Marks D S,Vita J A,Folts J D,et al.Inhibit ion of neointimal proliferation in rabbits after vascular injury by a single treatment with a protein adduct of nitric oxide[J].J Clin Invest,1995,96 (6):2630-2638.

[9]Biasin V,Chwalek K,W ilhelm J,et al.Endothelin-1 driven pro?liferation of pulomonary arterial smooth muscle cells is c-fos de?pendent[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,54:137-148.

[10]Ma J,Zhang L,Han W,et al.Activation of JNK/c-Jun is re?quired for the proliferation,survival,and angiogenesis induced by EET in pulmonary artery endothelial cells[J].J Lipid Res,2012, 53(6):1093-1105.

[11]Chen X,Liu H,Pan Z,et al.The inhibitory effects of mnisoldip?ine on the 5-hydroxytrytamine-induced proliferation of pulmo?nary artery smooth muscle cells via Ca2+antagonism and antioxi?dant mechanisms[J].Eur J Pharmacol,2012,686:32-40.

[12]Hardingham G E,Chaw la S,Johnson C M,et al.Distinct func?tions of nuclear and cytoplasmic calcium in the control of gene ex?pression[J].Nature,1997,385:260-265.

[13]董世山.肺動脈高壓在肉雞腹水綜合征發生發展過程中的作用[D].北京:中國農業大學,1999.

Expression of c-J un in the Small Pulmonary Arterials of Broilers in the Development of Ascites Syndrome Induced by Low Ambient Tem perature and the Arrest Effect of Verapam il

WANG Jian-lin1,QIAO Jian2
(1.College of Animal science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

Expression of c-Jun in pulmonary arterials of broilers in the development of ascites syndrome induced by low ambi?ent temperature and the effect of verapamil on the expression of c-Jun and occurrence of ascites syndrome were studied.15-day old broilers were divided into control group,low temperature group and verapamil group.The hearts and lungs in 6 broilers from ev?ery group were taken to study the index of right ventricular hypertrophy and the expression of c-Jun in pulmonary arterials respec?tively every week from 15 to 50 days old.The result showed that the index of right ventricular hypertrophy in low temperature groups was significantly higher than those in control group and verapamil group.The expression of c-Jun pulmonary arterials with 20～50 μm,50～100 μm and 100～200 μm diameters in broilers in low temperature group were significantly increased from 22 or 29 days to 50 days old compared with those in control group and verapamil group.The result suggested that the expression of c-Jun in pulmonary arterials with different diameters in broilers in the development of ascites syndrome were significantly increased, and blocking the calcium signal pathway could inhibit the high expression of c-Jun in pulmonary arterials and control the occur?rence of ascites syndrome in broilers.

broilers;ascites syndrom;pulmonary arterials;c-Jun;calcium signal

QIAO Jian

S858.31

A

0529-6005(2016)02-0009-03

2014-11-15

國家自然科學基金資助項目(30371063);山東省自然科學基金(ZR2013CL022)

王建琳(1976-),女,副教授,博士,主要從事禽病發生機制的研究,E-mail:bjsxxw@126.com

喬健,E-mail:qiaojian@cau.edu.cn