馬急性滑膜炎模型關節液中MMP-3和MMP-13含量變化的研究

王冠穎,姜仁禮,李欣然,范曉靜,李玥,劉旭,王晶璐,潘佳亮,陳希,馬云峰,趙洋,魏成威,韓光,高利

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱150030)

馬急性滑膜炎模型關節液中MMP-3和MMP-13含量變化的研究

王冠穎,姜仁禮,李欣然,范曉靜,李玥,劉旭,王晶璐,潘佳亮,陳希,馬云峰,趙洋,魏成威,韓光,高利

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱150030)

關節滑膜炎是骨關節疾病發病的基本病理過程,試驗通過研究馬急性滑膜炎關節液中基質金屬蛋白酶-3 (MMP-3)和基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)含量的變化,進而研究馬滑膜炎機理.試驗選用8匹馬,在馬右側中間腕關節內注入0.5 ng大腸桿菌脂多糖(LPS)誘導滑膜炎,同時在對側關節內注入等量的PBS作為對照,于注射藥物前和注射藥物后的8、24 h和168 h,采馬關節液,用ELISA檢測馬關節液中MMP-3和MMP-13的含量.結果注入LPS的關節液中MMP-3和MMP-13的量在注射后的24 h內持續升高,在24 h達到最大量10.01 ng/mL和6.08 ng/mL,與對照組比較差異性顯著,24 h后開始下降,168 h時含量恢復到對照水平.試驗結果表明,LPS誘導的滑膜炎模型為一過性的,在急性滑膜炎過程中,MMP-3和MMP-13的表達和釋放增加,并且這兩種酶在滑膜炎過程中起到重要作用.

滑膜炎;脂多糖;基質金屬蛋白酶-3;基質金屬蛋白酶-13

在馬的各種關節疾病中,滑膜炎是比較重要的疾病,滑膜炎程度的加重會造成軟骨的降解和退化.近些年來,研究表明,滑膜炎與關節的疼痛和關節功能異常有關,還會促進關節軟骨的降解[1].受到滑膜炎影響的關節組織,會產生一些炎癥因子和酶類,影響關節內的正常代謝,引起關節軟骨的降解退化.因此在對關節疾病機理研究中,滑膜炎機理的研究是比較重要的.而在促進關節軟骨退化的各類酶中,基質金屬蛋白酶(MMPs)起到重要的作用.本試驗通過用試驗的方法誘導馬腕關節的急性滑膜炎,檢測在滑膜炎過程中關節液中基質金屬蛋白酶-3和13含量的變化,揭示滑膜炎過程中軟骨退化的機理,為今后相關研究和預防這類疾病奠定基礎.

1　材料與方法

1.1試驗材料年齡在5～8歲的馬8匹,購自肇

東市某養殖場.按試驗動物要求飼養管理,臨床檢查健康.鹽酸地托咪定、鹽酸美沙酮及大腸桿菌O55∶B5脂多糖,購自Sigma公司;MMP-3和MMP-13 ELISA試劑盒,購自Shsaimo公司.

1.2試驗方法

1.2.1誘導滑膜炎給馬靜脈注射鹽酸地托咪定(10 μg/kg體重)和鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重),進行鎮靜.用PBS將大腸桿菌O55∶B5脂多糖(LPS)稀釋為0.5 ng/mL,在馬的右側中間腕關節內注入1 mL稀釋液,誘導滑膜炎.作為對照關節,在馬的對側關節中間腕關節內注入等量的PBS.

1.2.2關節液收集在關節內注射藥物前和在注射藥物后的8、24 h和168 h,給馬靜脈注射鹽酸地托咪定(10 μg/kg體重)和鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重),進行鎮靜,用注射器無菌抽取馬中間腕關節關節液,將關節液離心10 min(10 000 r/min),取上清液分裝入EP管中,-80℃保存.

1.2.3臨床癥狀的監測每次采集完關節液,記錄馬的體溫、呼吸、脈搏,并且進行跛行評估,評估標準參照美國馬獸醫協會(AAEP)制定的跛行分級標準[2],如表1所示.

表1　馬的跛行分級

1.2.4MMP-3和MMP-13的檢測用ELISA試劑盒檢測這4個時間點關節液中MMP-3和MMP-13的含量,按照試劑盒說明書進行操作.

1.3統計學分析數據用平均值±標準差表示.使用SPSS 19軟件數據分析系統做單因素方差分析,P<0.05為差異性顯著.

2　結果

2.1臨床結果這8匹馬的體溫、呼吸、脈搏在168 h內均在正常范圍內.而所有動物在注射藥物后4 h開始出現跛行,在8 h達到二級跛行,在24 h出現一級跛行,在168 h恢復正常.

2.2關節液中MMP-3的含量如表2所示:與對照關節相比,注入LPS的關節關節液中MMP-3的量在注射后的24 h內持續升高,在24 h達到最大量10.01 ng/mL,與對照組比較差異性顯著,在168 h含量恢復到對照水平.

表2　關節液中MMP-3的含量

2.3關節液中MMP-13的含量如表3所示:與對照關節相比,注入LPS的關節關節液中MMP-13的量在注射后的24 h內持續升高,在24 h達到最大量6.08 ng/mL,與對照組比較差異性顯著,在168 h含量恢復到對照水平.

表3　關節液中MMP-13的含量

3　討論

馬滑膜炎通常為其他關節疾病的開端,許多試驗研究表明,在馬的骨關節炎過程中滑膜炎是早期發病過程,這種發病過程會引起馬關節疼痛,還會使一些介質的產生增加,促進關節炎的發展,這些介質包括基質金屬蛋白酶、膠原酶、前列腺素、自由基等[3-5],繼而引起關節軟骨降解.

在本試驗中,在馬右側關節內注入大腸桿菌脂多糖,引起關節滑膜中滑膜細胞分泌一些炎癥介質,引發馬的滑膜炎,但是這種滑膜炎是急性的一過性的,整個炎癥過程持續一周,馬的跛行也在一周內恢復.在24 h內,馬出現跛行,表明此過程中出現劇烈的炎癥反應,而在此過程中檢測到馬關節液中MMP-3和MMP-13的量持續升高,達到10.01 ng/mL和6.08 ng/mL,與對照組有顯著的差異.有研究表明,體外培養馬的關節組織,用炎癥因子IL-1β刺激培養的組織,發現MMP-3的活性增加[6],同時IL-1β還可以誘導軟骨細胞中MMP-13的表達[7-8].這表明,在滑膜炎過程中,一些炎癥因子誘導MMP-3和MMP-13的表達和分泌,同時這兩種酶參與整個炎癥過程.

還有報道,基質金屬蛋白酶是一類Zn2+依賴性的內肽酶,這類酶參與關節軟骨的降解[9],并且基質金屬蛋白酶-3和基質金屬蛋白酶-13是這類降解酶中比較重要的酶[10-11],滑膜細胞和軟骨細胞都可以表達這種酶類.這表明,在滑膜炎過程中出現的關節軟骨降解可能與這兩種基質金屬蛋白酶有關.同時,在試驗中,對照關節中酶含量幾乎沒有變化,這說明滑膜穿刺對MMP-3和MMP-13的表達沒有顯著影響.

4　結論

在急性滑膜炎中,馬關節液中MMP-3和MMP-13的表達和釋放增加,這表明這兩種酶與骨關節炎初期軟骨的損傷有關,在關節軟骨退化過程中發揮重要作用.

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Changes in synovial fluid MMP-3 and MMP-13 from horses w ith experimentally-induced synovitis

WANG Guan-ying,JIANG Ren-li,LI Xin-ran,FAN Xiao-jing,LI Yue,LIU Xu,WANG Jing-lu, PAN Jia-liang,CHEN Xi,MA Yun-feng,ZHAO Yang,WEI Cheng-wei,HAN Guang,GAO Li
(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To study the synovitis mechanism of the horse,changes in synovial fluid MMP-3 and MMP-13 from horses with acute synovitis were analyzed.Acute synovitis was induced in 8 skeletally mature mares by a sterile intra-articular injection of 0.5 ng lipopolysaccharide(LPS)into the right middle carpal joint.The same doge sterile PBS was injected into the left control joint.Sy?novial fluid was collected at post injection hours(PIH)0,8,24 and 168.Concentrations of MMP-3 and MMP-13 were measured using ELISA kit.Our reslts showed that MMP-3 and MMP-13 increased steadily through PIH 24,and peaked at PIH 24 with the amount of 10.01 ng/mL and 6.08 ng/mL.The differences were significantly when compared with control group MMP-3 and MMP-13 returned to baseline by PIH 168.The results indicate injections of LPS into equine carpal joints resultes in a transient inflammatory response,and the expression and release of MMP-3 and MMP-13 are increased in acute synovitis.

synovitis;lipopolysaccharide;MMP-3;MMP-13

GAO Li

S857.165

A

0529-6005(2016)02-0028-03

2014-09-15

國家科技支撐計劃資助(2012BAD46B02-03)

王冠穎(1988-),女,碩士,從事臨床獸醫學方向研究,E-mail:misswang1988@sina.com

高利,E-mail:gaoli43450@163.com