玉屏風多糖對免疫抑制小鼠紅細胞免疫功能的影響

鄧樺,楊鴻,仝錫瑤,韓躍飛,計慧琴,蒲文珺

(佛山科學技術學院生命科學學院,廣東佛山528231)

玉屏風多糖對免疫抑制小鼠紅細胞免疫功能的影響

鄧樺,楊鴻,仝錫瑤,韓躍飛,計慧琴,蒲文珺

(佛山科學技術學院生命科學學院,廣東佛山528231)

為探討玉屏風多糖(YPF-P)對環磷酰胺(Cy)致免疫低下小鼠紅細胞免疫功能的影響,本試驗將90只SPF小鼠隨機分為空白對照組、免疫抑制組(Cy 80 mg/kg)、YPF-P不同劑量組(Cy 80 mg/kg+YPF-P 100、200、400 mg/kg)和陽性對照組(YPF-P 200 mg/kg),采用C3b受體花環法和免疫復合物花環法檢測紅細胞免疫黏附功能,測定血清IL-2和IFN-γ水平.結果發現,Cy可顯著降低小鼠的紅細胞免疫粘附功能、IL-2和IFN-γ水平,各劑量YPF-P均可較好調節和保護免疫抑制小鼠的紅細胞免疫粘附功能,增高紅細胞受體花環率和免疫復合物花環率,促進紅細胞免疫功能的恢復,同時可顯著提升IL-2和IFN-γ水平,調控T淋巴細胞活性.其作用以YPF-P 200 mg/kg最為明顯.

玉屏風多糖;免疫抑制;紅細胞免疫功能;IL-2;IFN-γ;小鼠

現代免疫學研究證明,紅細胞免疫是機體免疫系統的重要組成部分,紅細胞是血液循環中最重要的固有免疫細胞,參與機體免疫調控,具有識別、粘附、濃縮、促進吞噬、提呈抗原、激活補體及清除循環免疫復合物等能力,可增強T細胞產生γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、促進T細胞表達白細胞介素IL-2受體,并有完整的自我調控系統[1-3].

復方是中藥的精髓,中藥獨特用藥體系和復方方劑的特點,各組分間良好的量效關系能顯著提高單糖的功效[4].玉屏風多糖(YuPingFeng polysaccharides,YPF-P)為玉屏風散總多糖有效部位群,含黃芪多糖、白術多糖和防風多糖等,是該方劑臨床藥效的主要物質基礎.本項目的前期研究已發現YPF-P具有多方面的免疫調控作用[5],但目前玉屏風多糖對紅細胞免疫功能影響的研究報道尚較少見.本試驗采用環磷酰胺(Cy?clophosphamid,Cy),制備免疫抑制小鼠模型,采用紅細胞C3b受體花環試驗(Red blood cell C3b re?ceptor rosetting,RBC-C3bRR)及紅細胞免疫復合物花環試驗(Red blood cell immune complex roset?ting,RBC-ICR),以檢測YPF-P對小鼠紅細胞免疫功能的影響,同時檢測血清IL-2和IFN-γ水平,以觀察其對T淋巴細胞功能的影響,旨在為全面評價YPF-P的免疫調控作用提供試驗依據.

1　材料與方法

1.1實驗動物模型SPF級昆明小鼠,購自廣東省醫學實驗動物中心,合格證書號No.4407207211,雌雄各半.隨機分為空白對照組、免疫抑制對照組、多糖陽性對照組、多糖高、中、低劑量組,具體分組和給藥劑量見表1.

1.2玉屏風多糖的制備參照文獻[6]進行改進.將黃芪、白術、防風按3∶1∶1的重量配方,采用L9(34)正交試驗設計優化水提醇沉工藝,經大孔樹脂純化,真空冷凍干燥.經檢測玉屏風多糖平均含量為88.93%.

1.3血清IL-2和IFN-γ的測定每組隨機選擇6只小鼠采樣,于11 d摘眼球采血,分離血清.IL-2和IFN-γ按ELISA試劑盒(上海亞培生物科技有限公司,批號12032725)說明書進行檢測.

1.4RBC-C3bRR試驗

1.4.1C3b致敏酵母懸液制備選用馬鈴薯葡萄糖培養基培養酵母,用Hank′s液(含鈣、鎂,pH值7.2,下同)配成含1X108酵母細胞/m L的懸液,離心洗滌后加等量新鮮家兔血清混勻,37℃水浴,致敏20 min,以Hank′s液洗2次,恢復原濃度,即為C3b致敏酵母細胞懸液.

1.4.2小鼠紅細胞懸液制備小鼠摘眼球放血,肝素抗凝,離心洗滌3次后,用Hank′s液稀釋成1.25X107/mL的紅細胞懸液.

1.4.3檢測方法取C3b致敏酵母懸液和紅細胞懸液各50 μL,混勻,于37℃水浴40 min后取出,輕輕搖起,加0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min,用適量Hank′s液稀釋,涂片,干燥,甲醇固定,姬姆薩染液染色,高倍鏡檢查,以1個紅細胞粘附2個或2個以上酵母細胞為1個花環,計數200個紅細胞,求出花環率.

1.5RBC-ICR試驗酵母用Hank′s液洗滌后無需血清致敏,直接配成1X108/mL濃度,即為非致敏酵母懸液.其余步驟同1.4.2和1.4.3.

表1　實驗動物分組和給藥劑量

表2　小鼠IL-2、IFN-γ、RBC-C3bRR和RBC-ICR的變化

表2　小鼠IL-2、IFN-γ、RBC-C3bRR和RBC-ICR的變化

注:同列數據右上標小寫字母不同者表示P<0.05;大寫字母不同者表示P<0.01

動物模型分組多糖劑量(mg/kg)IL-2(pg/m L)IFN-γ(pg/m L)RBC-C3bRR RBC-ICR 1組(空白對照)-34.45±4.0cB75.10±11.4dB10.83±3.3aA9.75±4.1aA2組(免疫抑制對照)-22.19±3.0aA32.79±12.0aA7.38±2.6bA8.14±2.6aA3組(多糖高劑量)400 24.80±3.4aA46.20±8.8bA17.67±5.7cB14.53±3.5bA4組(多糖中劑量)200 28.43±4.4bAB57.17±5.9cB19.56±6.1cB12.71±2.9cA5組(多糖低劑量)100 35.03±7.3cB55.33±5.4cB14.58±7.4dB11.06±5.1cA6組(多糖陽性對照)200 53.34±2.6D73.13±7.1dB35.50±8.6C34.92±7.8B

2　結果

2.1IL-2水平的變化由表2可見,2組IL-2水平為最低,與空白對照組比較P<0.01,與多糖中、低劑量組比較P<0.05,但與高劑量組無明顯差異;各劑量組之間比較可見,以低劑量組為高,且明顯高于高、中劑量組(P<0.01或P<0.05),中劑量組次之,且高于高劑量組P<0.05,高劑量組為最低.結果提示Cy可顯著降低IL-2水平,而此過程可被中、低劑量YPF-P緩解和改善,而劑量過高效果反而下降.6組IL-2水平為所有組別中最高,與1～5組相比P<0.01,提示YPF-P可顯著增強正常小鼠的IL-2水平.

2.2IFN-γ水平的變化2組IFN-γ水平為最低,與空白對照組和多糖中、低劑量組比較P<0.01,與高劑量組比較P<0.05;各劑量組之間比較可見,以低、中劑量組為高,與高劑量組相比P< 0.01,高劑量組為最低.結果提示Cy可顯著降低IFN-γ水平,而此過程可被中、低劑量YPF-P緩解和改善,而加大劑量并不能持續增加IFN-γ水平.6組顯著高于2、3組(P<0.01),與4～5組比較P<0.05,與空白對照組持平.

2.3小鼠RBC-C3bRR的變化2組最低,與1組相比P<0.05,與3～6組相比P<0.01,提示Cy可顯著降低小鼠紅細胞免疫粘附功能.3～5組與1組相比明顯增高(P<0.01),而各劑量組之間,高、中劑量組比低劑量組高(P<0.05),提示高、中劑量可較好保護環磷酰胺所致的紅細胞免疫功能下降.6組為最高,與1～5組相比P<0.01,提示YPF-P可顯著提升正常小鼠的紅細胞免疫功能.詳見表2. 2.4小鼠RBC-ICR的變化由表2可見,多糖各劑量組與空白對照組和免疫抑制組相比,3～5組RBC-ICR升高(P<0.05),提示YPF-P可提高小鼠紅細胞清除免疫復合物的能力;而各劑量組之間,高劑量組比中、低劑量組升高更為明顯(P< 0.05);與1～5組相比,6組RBC-ICR為最高(P< 0.01),提示YPF-P可顯著提升正常小鼠的紅細胞粘附功能,增強對免疫復合物的清除.

3　討論

3.1YPF-P對小鼠紅細胞免疫粘附功能的調節作用紅細胞免疫粘附功能主要是通過其表面I型補體受體CR1,發揮清除免疫復合物的作用,研究紅細胞CR1介導的免疫粘附功能對評價機體天然免疫功能狀況乃至特異性細胞或體液免疫都具有十分重要的意義[7].本試驗結果證實,環磷酰胺可顯著降低小鼠紅細胞免疫粘附功能,各劑量YPF-P均可較好調節和保護環磷酰胺所致的紅細胞免疫粘附功能下降,增高RBC-C3bRR,促進紅細胞免疫粘附功能的恢復,提示YPF-P對紅細胞免疫粘附功能具有正向調節作用.RBCICR反映了結合狀態的CR1數目,與血液中IC含量有關.本試驗發現,YPF-P高劑量組和多糖陽性對照組RBC-ICR顯著升高,提示YPF-P可顯著提升小鼠紅細胞粘附功能,增強對免疫復合物的清除,與文獻報道一致[4].

3.2YPF-P對小鼠T細胞功能的調節作用有研究發現紅細胞對T細胞的生長、存活和分化有調控作用,能促使T細胞分泌IFN-γ和表達IL-2[8-9].本試驗結果證實了上述觀點,環磷酰胺可顯著降低小鼠血清IL-2和IFN-γ水平,而此過程可被YPF-P顯著緩解和改善,提示YPF-P可通過平衡紅細胞活性以糾正淋巴細胞活性的病理狀態.

結合本試驗與前期結果分析[5],YPF-P可全面提升機體的免疫功能,對小鼠紅細胞免疫、體液免疫和細胞免疫均有明顯的調控作用,并存在最佳劑量效應.

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Effects of YuPingFeng Polysaccharides on Erythrocyte Immune Function in ImmunosuppressiveM ice

DENG Hua,YANG Hong,TONG Xi-yao,HAN Yue-fei,JI Hui-qin,PU Wen-jun
(College of life science,Foshan University,foshan 528000,China)

To study the effects of YuPingFeng polysaccharides(YPF-P)on erythrocyte immune function in immunosuppres?sive mice by cyclophosphamid(Cy),90 mice were randomly divided into 6 groups:blank-control group,immunosuppression-con?trol group(Cy 80 mg/kg),YPF-P different dose groups(Cy 80 mg/kg+YPF-P 100,200,400 mg/kg)and positive-control group (YPF-P 200 mg/kg).Red blood cell C3b receptor rosetting assay(RBC-C3bRR)and red blood cell immune complex rosetting as?say(RBC-ICR)were used to investigate red cell immune adherence function(RCIA).Serum levels of IL-2 and IFN-γ were detect?ed to explore the activity of T lymphocytes.The results showed that RCIA,and serum levels of IL-2 and IFN-γ significantly re?duced in immunosuppression mice caused by Cyclophosphamide.All different YPF-P doses could regulate and protect RCIA de?cline in immunosuppression mice,heighten the rate of RBC-C3bRR and RBC-ICR,promote the recovery of red cell immune func?tion,and significantly increase the level of IL-2 and IFN-γ simultaneously,and regulate the activity of T cells.200 mg/kg YPF-P was the most obvious in those effects.

YuPingFeng polysaccharides(YPF-P);Immunosuppressive;erythrocyte immune function;IL-2;IFN-γ; mice

R 392.3,R 285.5

A

0529-6005(2016)02-0056-03

2014-11-21

廣東省自然科學基金項目(S2013010012191)

鄧樺(1968-),女,教授,博士,研究方向為基礎醫學,E-mail:denghuaa@163.com