生育期金雀異黃素干預對親代大鼠生育能力的影響

孫曉溪　張云波　郭紀鵬　那曉琳哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江哈爾濱　150081

生育期金雀異黃素干預對親代大鼠生育能力的影響

孫曉溪張云波郭紀鵬那曉琳
哈爾濱醫科大學公共衛生學院，黑龍江哈爾濱150081

目的 探討生育期金雀異黃素干預對親代大鼠體重及生育能力的影響。方法 SPF級性成熟8周齡雌雄SD大鼠實驗室適應1周后，隨機分為4組，分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組以及對照組，每組雌鼠8只，雄鼠4只。按雌雄比例為2∶1進行合籠交配，同時給予含有相應劑量的金雀異黃素的高脂飼料干預3周。其中，低、中、高劑量金雀異黃素組每千克飼料分別加入金雀異黃素600、1800、5400mg，對照組不添加金雀異黃素。實驗期間每周稱量體重，實驗結束后摘取臟器稱重，觀察雄性大鼠精子密度及母鼠懷孕率。結果 與對照組比較，高劑量金雀異黃素可以降低母鼠及父鼠體重，差異有統計學意義（P＜0.05）。同時高劑量金雀異黃素可以降低雄性大鼠精子密度，降低母鼠受孕率。結論 生育期金雀異黃素干預可以顯著降低親代大鼠的生育能力。

金雀異黃素；生育能力；精子密度；受孕率

金雀異黃素是一種大豆體內天然存在的異黃酮類物質，能與機體內雌激素受體結合而顯示出一定的類雌激素樣作用［1］。近年來，許多研究表明，金雀異黃素具有抗氧化、抗癌、預防骨質疏松癥、預防心血管疾病、改善婦女更年期癥狀、抗衰老等諸多生理功能［2-5］。近年來，隨著大豆深加工產業的發展，出現了大量的大豆濃縮制品以及大豆異黃酮制劑等大豆類提純產品，人們對金雀異黃素的接觸也超過了傳統意義上的膳食接觸水平。金雀異黃素作為一種環境雌激素，其潛在的毒性作用也越來越受人們重視［6-7］。而現有的研究中，缺乏金雀異黃素暴露對生育期母鼠及雄鼠生殖系統的影響。本實驗即通過孕期及哺乳期高劑量金雀異黃素干預母鼠及父鼠，探討其對親代大鼠生殖系統的影響，同時觀察其對子鼠產量的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料及動物

受試樣品：大豆異黃酮總含量為98%（西安奧澤生物科技有限公司）。SPF級8周齡SD大鼠48只（北京維通利華實驗動物科技有限公司，合格證號：NO.1140070 0005694），雌性32只，雄性16只。體重為180～200 g。

1.2實驗方法

1.2.1飼料配制

本實驗動物飼料在AIN-93M基礎上進行配制，將不同劑量的金雀異黃素均勻混合在飼料中。分為高劑量組、中劑量組、低劑量組以及對照組。低、中、高劑量金雀異黃素組每千克飼料分別加入金雀異黃素600、1800、5400mg，對照組不添加金雀異黃素。飼料配方：成分玉米淀粉350 g/kg、酪蛋白160 g/kg、糊精化玉米淀粉89.5 g/kg、蔗糖100 g/kg、玉米油50 g/kg、豬油150 g/kg、纖維素50 g/kg、混合礦物質35 g/kg、混合維生素10 g/kg、L-胱氨酸3 g/kg、豬膽鹽2.5 g/kg。

1.2.2動物分組與處理

8周齡性成熟雌雄大鼠，實驗室適應1周后進行隨機分組，每組雌鼠8只，雄鼠4只。分別為：高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組。按雌雄比例為2∶1進行合籠交配，各組同時給予含有相應劑量的金雀異黃素的高脂飼料。各組大鼠自由攝食，待子鼠完全出生后處死母鼠及父鼠，檢測相關指標。

1.2.3檢測指標和方法

1.2.3.1實驗期間觀察孕鼠的生長和攝食情況，每周稱量體重1次。

1.2.3.2實驗期間觀察父鼠的生長和攝食情況，每周稱量體重1次，記錄飼養3周后的體重。

1.2.3.3實驗結束后取各臟器稱重，雌性大鼠取子宮、卵巢稱重，雄性大鼠取睪丸、附睪稱重。

1.2.3.4檢測精子密度，取兩側附睪置于一次性試管中，加入4 mL生理鹽水，剪碎組織后于37℃水浴孵育4min。取中間懸浮液10μL置于2mL EP管中，加入990μL生理鹽水，稀釋100倍后，取100μL鋪片后，10×10倍鏡下觀察。

1.2.3.5受孕率，受孕率=（受孕只數/母鼠例數）×100%。

1.3統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1實驗期間不同劑量金雀異黃素對母鼠及父鼠體重的影響

實驗期間不同劑量金雀異黃素對母鼠：實驗前各組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）；金雀異黃素干預后，各實驗組的體重逐漸產生差異；大豆異黃酮干預1周時，高劑量組母鼠體重明顯降低，與其他三組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；大豆異黃酮干預3周時，高、中劑量組與對照組相比，體重顯著降低（P＜0.05）；同時，隨著劑量的增加，雌鼠的體重明顯降低，具有明顯的劑量-反應關系。實驗期間金雀異黃素對父鼠體重的影響：實驗前各組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）；金雀異黃素干預1周后，高劑量組父鼠體重增長緩慢；到3周末，高劑量和低劑量金雀異黃素干預可以降低父鼠體重，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.2不同劑量金雀異黃素干預對母鼠及父鼠臟體比的影響

高劑量金雀異黃素干預可以顯著降低母鼠及父鼠脂肪的臟體比（P＜0.05）。同時有增加母體子宮臟體比的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。其對母鼠其他臟器如腦、肝臟、腎臟、卵巢的臟體比無明顯影響（P＞0.05）。同時發現，金雀異黃素對父鼠睪丸及附睪的臟體比無明顯影響（P＞0.05）。見表2。

2.3不同劑量金雀異黃素干預對父鼠精子密度及產子量母鼠受孕率的影響

表1　實驗期間不同劑量金雀異黃素干預對母鼠及父鼠體重的影響（g，±s）

表1　實驗期間不同劑量金雀異黃素干預對母鼠及父鼠體重的影響（g，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別　母鼠只數　0周　1周　2周　3周父鼠只數　0周　1周　2周　3周高劑量組中劑量組低劑量組對照組8888 219.34±10.24 219.05±5.33 219.33±8.47 219.38±8.11 231.81±12.36*245.37±8.1 251.98±6.91 256.17±15.65 243.63±11.75*261.42±19.67 276.93±16.18 279.6±19.36 241.33±10.54*271.97±25.37*289.8±18.74 307.47±36.16 4444 272.45±7.66 267.70±12.64 267.80±6.71 269.00±7.70 294.20±12.85*311.47±28.22 312.13±7.78 328.87±8.83 357.15±46.14 391.40±22.86 389.37±21.37 403.03±14.80 385.00±13.14*422.67±20.13 399.67±18.5*443.33±9.45

高劑量及中劑量金雀異黃素顯著降低父鼠精子密度（P＜0.05）。同時，隨著金雀異黃素劑量的增加，母鼠受孕率顯著減少（P＜0.05）。并且隨著劑量的增加，子鼠雌性比例增高（P＜0.05）。見表3。

圖1　實驗期間不同劑量金雀異黃素干預對母鼠及父鼠體重的影響

3　討論

金雀異黃素對大鼠的影響目前國內外的結果都不盡相同，但大部分集中在其作為雌激素替代劑對絕經后雌鼠的影響以及對腫瘤的抑制作用。其原因可能與給藥劑量、給藥時間、接觸期限以及給藥方式等有關［8-10］。本實驗中，采用孕期及懷孕準備期同時給予母鼠及父鼠金雀異黃素，探討其對母鼠及父鼠體重、臟體比以及生殖能力的影響。本研究發現，高劑量金雀異黃素干預可以降低母鼠及父鼠的體重，同時降低母鼠的脂肪臟體比，并且具有明顯的劑量-反應關系。此外，高劑量及中劑量金雀異黃素干預可以顯著降低父鼠的精子密度，同時降低雌鼠的受孕率。

目前對于孕期金雀異黃素干預對母鼠體重的影響國內鮮有報道，且大部分都是以大豆異黃酮為干預對象。Kishida等［11］發現通過飲食攝入100～300mg/kg飼料大豆異黃酮可以顯著降低7周齡雌鼠的體重，Zhang等［12］發現3600 mg/kg飼料大豆異黃酮顯著降低去卵巢雌鼠的體重，其原因是通過抑制攝食量引起的體重降低。這與本研究的結果基本一致。

表2　不同劑量金雀異黃素干預對母鼠及父鼠臟體比的影響（±s）

表2　不同劑量金雀異黃素干預對母鼠及父鼠臟體比的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別　母鼠只數　脂肪　子宮　卵巢父鼠只數　脂肪　睪丸　附睪高劑量組中劑量組低劑量組對照組8888 1.28±0.59*1.60±0.66 2.13±0.89 3.45±1.06 0.23±0.07 0.21±0.05 0.19±0.09 0.17±0.04 0.06±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 4444 1.93±0.41*2.46±0.44 1.96±0.18*2.82±0.44 0.77±0.05 0.73±0.05 0.85±0.06 0.74±0.10 0.32±0.02 0.31±0.08 0.33±0.02 0.33±0.09

表3　不同劑量金雀異黃素干預對父鼠精子密度及產子量母鼠受孕率的影響（±s）

表3　不同劑量金雀異黃素干預對父鼠精子密度及產子量母鼠受孕率的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別雌性子鼠比例（%）父鼠只數　精子密度（×108）母鼠只數　受孕率（%）高劑量組中劑量組低劑量組對照組4444 132.25±26.55*214.67±19.01*222.33±30.07 285.00±49.50 8888 0.00 37.50*50.00*87.50*0.00 61.11*56.25*47.82*

Caceres等［13］發現高劑量大豆異黃酮干預雄鼠，大鼠體重和體重增重量均明顯減輕，這與本試驗結果一致。說明其影響了雄性大鼠的體重增長，對雄鼠的生長發育產生了負面作用。

本研究中，發現各劑量組金雀異黃素干預對母鼠及父鼠腦、肝臟、腎臟、脾臟等臟器的臟體比均無顯著性影響，但顯著降低脂肪的臟體比。這與Zhang等［14］的研究一致。其機制可能是與其誘導3T3-L1細胞凋亡有關［15-16］。

大豆異黃酮具有雌激素樣作用和抗雌激素樣作用，其是否對雄性生殖系統產生副作用仍存在爭論［17］。本研究發現高劑量和中劑量的金雀異黃素干預可以顯著降低父鼠的精子密度，同時降低母鼠的受孕率。崔洪斌等［18］發現高劑量的大豆異黃酮破壞了雄性大鼠的睪丸結構，使其功能喪失，不能產生成熟精子，因此影響了雄性大鼠的性發育。孫合濤等［19］研究發現孕期暴露大豆異黃酮對雄性子鼠的生殖發育的影響跟大豆異黃酮存在關系，當大豆異黃酮劑量較高時將對雄性子鼠生殖發育產生毒性作用。大豆異黃酮孕期和出生后暴露可干擾子鼠雄性生殖系統的發育，ER-β受體表達變化可能是其機制之一［20］。此外，本研究發現隨著劑量的增加，子鼠中雌鼠比例增高，這可能與金雀異黃素的雌激素樣作用有關。

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Effect of genistein on fertility of parental rats in the period of mating

SUN Xiaoxi ZHANG YunboGUO JipengNA Xiaolin
Public Health College，Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Harbin150081，China

Objective To explore the effect of genistein on body weight and fertility of parental rats in the period of mating.Methods After adaption for 1 week，8 weeks female and male SD rats were randomized to 4 groups:high-dose group，middle-dose group，low-dose group and control group，8 female rats and 4male rats in each group.Female and male rats were mating at ratio of 2∶1.Different dosage of genistein were given at the beginning of mating fed with highfat diet for 3 weeks.The high，meddle and low dose groups were given 5400，1800，600mg genistein into every kg fodder diet respectively.No genistein was added in control group.Body weight was weighted every week.The organ weights of male and female rats were weighted，the sperm density of male rats and pragnancy rate of female rats were observed at the end of experiment.Results Compared with control group，body weight of female rats in high-dose group decreased，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Meanwhile，the sperm density of male rats and pregnancy rate of female rats reduced in high-dose genistein group.Conlusion Genistein can reduce fertility of parental rats in the period of mating.

Genistein；Fertility；Sperm density；Pregnancy rate

R285

A

1673-7210（2016）01（c）-0004-04

2015-10-11本文編輯：蘇暢）

國家自然科學基金資助項目（81202190）。

孫曉溪（1987-），女，哈爾濱醫科大學環境衛生學專業2013級在讀碩士研究生；研究方向：大豆異黃酮的效能。

那曉琳（1964-），女，博士，教授；研究方向：植物雌激素活性。