Actinonin與肽脫甲酰基酶作用模式的分子動力學模擬研究

高　劍　王　濤　孫　杰　牟　杰徐州醫學院　江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇徐州　221004

Actinonin與肽脫甲酰基酶作用模式的分子動力學模擬研究

高劍王濤孫杰牟杰
徐州醫學院江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇徐州221004

目的 研究actinonin與脫甲酰基酶的相互作用模式，闡述基于actinonin進行特異性人肽脫甲酰基酶（HsPDF）抑制劑設計思路。 方法使用分子動力學模擬和MM/GBSA自由能計算等方法來研究各種肽脫甲酰基酶（PDF）與actinonin的相互作用模式，定量描述PDF關鍵殘基與actinonin的結合自由能。結果 在與actinonin結合方面，HsPDF作為PDF1A的代表，與PDF1B和PDF2比較，存在3個明顯差異：與HsPDF的motif 1相互作用較強，與motif 2較弱，而與PDF1B和PDF2的motif 1相互作用較弱，而與motif 2相互作用較強；與HsPDF的Leu131和Met145相互作用較強，而這些相互作用在PDF1B和PDF2是不存在的；與HsPDF的Trp207存在很強的結合自由能，而與PDF1B和PDF2在相同位置的殘基相互作用較弱。結論利用分子動力學模擬的方法，研究actinonin與PDF的相互作用模式，闡述HsPDF與其他類型PDF在活性位點的差異，為基于actinonin的特異性HsPDF抑制劑的設計提出了思路。

分子動力學模擬；肽脫甲酰基酶；Actinonin；抗腫瘤；抗菌

肽脫甲酰基酶（peptide deformylase，PDF）是含鐵金屬蛋白酶，功能是脫去新生成的N-甲酰甲硫氨酸多肽的N-甲酰基，是蛋白質合成過程中必不可少的一種酶［1-2］。PDF有3種類型：PDF1、PDF2、PDF3，是無脫甲基化功能，其中PDF1又分為兩個亞型，PDF1A（如HsPDF）和PDF1B（細菌PDF）［3-5］。原核細胞中的PDF已被當作極具潛力的抗菌靶標，且大量PDF抑制劑已經被報道［6-10］。然而肽脫甲酰基酶（PDF-like）也存在于真核細胞中，如寄生蟲、植物、甚至哺乳動物的人類［4，11-12］。HsPDF分布于人的線粒體中，同樣具有對底物多肽的脫甲基化的功能［13-16］，而這對于線粒體中DNA所編碼蛋白的積聚和裝配至關重要［17］。抑制HsPDF將降低線粒體的呼吸功能及相應的能量產生，最終導致細胞死亡［17］。最新研究也證實HsPDF在乳腺癌、結腸癌和肺癌中高表達，抑制HsPDF將明顯降低癌細胞的增殖［18］。林超等［19］研究表明，HsPDF基因在Hela、MDA-MB-231、K562等腫瘤細胞中高表達，而在人正常肺組織中低表達（P＜0.01），Actinonin（圖1）是首個天然來源的細菌PDF抑制劑［7］，被證實是有潛力的HsPDF抑制劑 （IC50為43 nmol/L）［20-21］。因此，HsPDF是極具潛力的新型抗腫瘤靶標。然而以actinonin為代表的HsPDF抑制劑由于其可以同時抑制人體內的細菌群的PDF蛋白酶而制約著此類抑制劑的發展［22］，亟待特異性HsPDF抑制劑的設計與開發。

圖1　PDF抑制劑actinonin的結構

組合使用分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬和結合自由能計算的方法已經成熟應用于定量描述蛋白-蛋白和蛋白-小分子相互作用模式中［23-29］。為了闡述各個類型PDF蛋白酶抑制劑結合位點的特性，設計了7個PDF（1個PDF1A、3個PDF1B和3個PDF2）與其抑制劑actinonin形成復合物的體系，利用分子動力學模擬和結合自由能計算等方法，定量描述了多種類型PDF蛋白酶抑制劑結合位點的共性與差異性。7個體系是由1個PDF1A（HsPDF-actinonin）、3個PDF1B［包括聚球藻類噬菌體S-SSM7 PDF-actinonin（簡稱SpPDF-actinonin）、幽門螺桿菌PDF-actinonin（簡稱HpPDF-actinonin）和擬南芥PDF-actinonin（簡稱At PDF-actinonin）］和3個PDF2［包括金黃色葡萄球菌PDF-actinonin（簡稱SaPDF-actinonin）、嗜熱脂肪芽孢桿菌PDF-actinonin（簡稱BsPDF-actinonin）和蠟樣芽孢桿菌PDF-actinonin（簡稱BcPDF-actinonin）］組成的。

1　資料與方法

1.1模擬體系構建

以上提及的7個復合物體系均來自于蛋白質數據庫（PDB）［30］，相應晶體結構PDB號分別為HsPDF-actinonin：3G5K［22］、SpPDF-actinonin：3UWB［31］、HpPDF-actinonin：4E9B、AtPDF-actinonin：3M6P［32］、SaPDF-actinonin：1Q1Y［33］、BsPDF-actinonin：1LQY［3］和 BcPDF-actinonin：2OKL［34］。7個晶體結構均含有抑制劑actinonin。

圖2　7種PDF蛋白酶的序列比對

1.2分子動力學（MD）模擬和相應的分子力場

7個復合物體系的能量優化和分子動力學模擬均采用Amber12分子動力學程序包，PDF酶的參數采用FF03力場，actinonin的參數采用GAFF力場。每個體系置于TIP3P水分子的立方體盒中，并保證復合物的四周均包上厚度為12的水層。為使各個體系呈現電中性，適量的Na+以替換相同數量水分子的形式加入體系中。每個體系先利用sander模塊進行能量優化。之后對每個體系進行60 ps的逐步升溫過程（0～300 K），體系處于NVT的系綜中。每個體系的MD模擬均在恒溫300 K下運行20 ns，步長是2 fs。

1.3MM/GBSA結合自由能計算方法

PDF與actinonin的結合自由能的計算采用MM/ GBSA方法，由MM_PBSA和Nmode模塊來完成，計算公式如下：

其中ΔEMM為氣相分子間相互作用能，包括范德華（ΔEvdw）和靜電相互作用（ΔEele），ΔGGB和 ΔGSA分別代表了極性溶劑化和非極性溶劑化效應，-TΔS代表了溫度的熵變。每個體系的結合自由能計算是基于最后10 ns的軌跡中均勻選取的400個構象得到的。

1.4MM/GBSA自由能分解

為了定量計算受體PDF活性位點殘基與抑制劑的相互作用能，采用Mm_Pbsa模塊進行MM/GBSA自由能分解。單個殘基與抑制劑的結合自由能同樣包含3個部分：范德華、靜電相互作用和溶劑化貢獻。

2　結果

2.1MD模擬軌跡分析

為了考察每個體系在分子動力學模擬過程中蛋白結構構象的穩定性，計算了蛋白主鏈骨架原子相對于初始構象的均方根偏差（RMSD），如圖3所示。所有7個體系在較短的時間內就達到穩態，RMSD值均在1.2左右。7個體系在10 ns之后均達到穩態，從最后10 ns的軌跡中選取400個構象進行結合自由能計算是合理的。

2.2MM/GBSA結合自由能計算

采用MM/GBSA計算PDF與actinonin的結合自由能，結果列于表1。actinonin與HsPDF、SpPDF、HpPDF、AtPDF、BcPDF、SaPDF和BsPDF的結合自由能分別為-115.81、-123.31、-150.17、-130.40、-119.42、-126.44 kJ/mol和-127.28 kJ/mol。每個體系計算得到的結合自由能與實驗值（p IC50）的相關系數較高（r2= 0.81）。范德華作用對抑制劑與PDF蛋白酶結合起關鍵作用，總的非極性相互作用（ΔEvdw+ΔGSA，簡稱為ΔG1）的貢獻明顯高于極性相互作用（ΔEele+ΔGGB，簡稱為ΔG2）的貢獻。

2.3MM/GBSA自由能分解

各種PDF氨基酸序列同源性不高，但大多存在3個保守的氨基酸片段：GXGXAAXQ（motif 1）、EGCLS（motif 2）和HEXXH（motif 3）（X代表任意殘基）。MM/ GBSA自由能分解得到了單個殘基與抑制劑定量的相互作用能（圖4）也顯示出actinonin與7個不同的PDF起關鍵相互作用的殘基大都歸屬于上面3個片段。actinonin在 3個 PDF1B類型（SpPDF、HpPDF和AtPDF）和3個PDF2類型（BcPDF、SaPDF和BsPDF）中的結合模式較為相似（圖4）。actinonin與PDF1A類型（HsPDF）的結合模式與之前6個體系比較存在一定差異，如HsPDF中的L131和M145。另外，HsPDF 中207位的氨基酸是色氨酸，而該位置在其他類型PDF酶中多是亮氨酸。

圖3　MD模擬過程中蛋白主鏈骨架原子相對于初始構象的均方根偏差

為了進一步考察actinonin與不同類型PDF酶相互作用的共性與差異性，3個保守片段及其他重要殘基在結合自由能中的貢獻結果列于表2。actinonin與HsPDF的motif 1的結合自由能（-29.45 kJ/mol）強于與其他類型的motif1（均在-25 kJ/mol附近），與motif2的結合自由能（-19.62 kJ/mol）弱于PDF2型，更低于PDF1B型，與motif 3的結合自由能與其他兩種類型比較沒有明顯差異（圖4）。另外，actinonin與HsPDF 的Leu131和Met145有-3.18 kJ/mol和-3.14 kJ/mol的結合自由能，而與其他兩種類型PDF在相同位置的殘基相互作用為零，這些結果也在圖5（封三）中呈現出。最后，actinonin與HsPDF的Trp207有極強的結合自由能（-11.72 kJ/mol），而與其他類型PDF相互作用較弱。

表1　7個體系各自的結合自由能及各能量項對結合自由能的貢獻

圖4　各種PDF與actinonin的相互作用

表2　actinonin與關鍵氨基酸片段總的結合自由能（kJ/mol）

3　討論

PDF可以作為抗菌和抗腫瘤的雙重靶標。PDF作為抗菌靶標研究較早并且已經有幾個小分子化合物進入臨床試驗，而基于HsPDF進行抗腫瘤的研究起步較晚，尚無良好的HsPDF抑制劑。actinonin作為高效的細菌PDF抑制劑同時也顯示出較強的HsPDF抑制活性，但其同時抑制多種PDF酶而限制了HsPDF抑制劑的發展。設計高特異性的HsPDF抑制劑將明顯降低其對其他類型PDF的抑制活性而具有低毒副作用。為此，利用分子動力學模擬和結合自由能計算來研究actinonin與7個PDF的相互作用，通過定量考察actinonin與PDF活性位點殘基的相互作用能來揭示actinonin結合于不同PDF時的差異：actinonin 與HsPDF的motif 1相互作用較強，與motif 2較弱。actinonin與PDF1B和PDF2的motif 1相互作用較弱，而與motif 2相互作用較強。同時，actinonin與HsPDF的Leu131和Met145為主的Helix 2和Helix 3的相互作用較強，而這些相互作用在PDF1B和PDF2是不存在的。最后，actinonin與HsPDF的Trp207有較強的結合自由能，而與PDF1B和PDF2在相同位置的殘基相互作用則較弱。這些信息將為今后基于HsPDF進行抗腫瘤藥物的發展提供理論指導。

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Molecular dynamics simulation on the molecular interactions of peptide deformylase and actinonin

GAO JianWANG Tao SUN Jie MOU Jie
Xuzhou Medical CollegeJiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy，Jiangsu Province，Xuzhou221004，China

Objective To investigate the binding modes between actinonin and peptide deformylases and to characterize the informations about how to design the specific HsPDF inhibitor.Methods The combination of molecular dynamics simulation and MM/GBSA free energy calculation was employed to study the interactions between several PDF enzymes and actinonin.The detailed interactions of each residues of protein and actinonin were calculated by MM/GBSA free energy decomposition.Results Three important differences in actinonin binding to PDFs were obtained as followed: actinonin had stronger binding interaction with the motif 1 of HsPDF than the motif 2，while actinonin had lower binding interaction with the motif 1 than the motif 2 for PDF1A and PDF2.Moreover，actinonin had stronger binding affinities with Leu131 and Met145 of HsPDF，but had no interaction with the corresponding ones of PDF1A and PDF2.In addition，actinonin interacted strongly with Trp207 of HsPDF but weakly with the corresponding residue of PDF1A and PDF2.Conclusion By using the method of molecular dynamics simulation，the interaction of actinonin and PDFmodel are studied，differences of HsPDF and PDF in the active site with other types are expounded，based on the design thinking of specific HsPDF inhibitors of actinonin is proposed.

Molecular dynamics simulation；Peptide deformylase；Actinonin；Anticancer；Antibacterial

R75

A

1673-7210（2016）01（c）-0021-06

2015-09-22本文編輯：任念）

江蘇省青年科學基金項目（BK20140225）；徐州醫學院優秀人才科研啟動基金資助項目（D2014008）。