綿羊GDF9基因mRNA、DNA和調控區序列克隆及其在11個品種中遺傳多態性檢測

潘章源，賀小云，劉秋月，胡文萍，王翔宇，郭曉飛，曹曉涵，狄　冉，儲明星

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部畜禽遺傳資源與種質創新重點實驗室，北京 100193)

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綿羊GDF9基因mRNA、DNA和調控區序列克隆及其在11個品種中遺傳多態性檢測

潘章源，賀小云，劉秋月，胡文萍，王翔宇，郭曉飛，曹曉涵，狄冉*，儲明星*

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部畜禽遺傳資源與種質創新重點實驗室，北京 100193)

本研究旨在克隆綿羊生長分化因子9(Growth differentiation factor 9，GDF9)基因mRNA、DNA和調控區全序列，并檢測其在11個綿羊品種中的遺傳多態性，探究GDF9基因與綿羊多羔性狀的關系。首先應用RACE和PCR技術克隆GDF9基因全長序列，其次利用SNaPshot分型技術檢測11個綿羊品種GDF9基因遺傳多態性。結果顯示，克隆獲得GDF9基因mRNA全長1 852 bp(GenBank序列號：KR063137)，編碼區兩側翼分別具有5′-UTR 58 bp(1～58 nt)和3′-UTR 432 bp(1 421～1 852 nt)。進一步克隆獲得長為2 898 bp的DNA序列和2 304 bp的調控區序列，分析發現調控區序列比數據庫序列(NC_019462.1)多兩個長片段。序列比對發現了已知突變G260A(G1)和調控區新突變-2078C>G。分型結果顯示，11個綿羊品種均不含FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突變，而G260A和-2078C>G廣泛存在于除草原型藏羊外的各綿羊品種中，G260A表現3種基因型(AA、BB和AB)，首次在小尾寒羊和山谷型藏羊中檢測到BB型突變純合子。-2078C>G也存在3種基因型，基因型結果表明該位點與G260A完全連鎖。關聯分析結果顯示，小尾寒羊AB型產羔數顯著高于AA型(P<0.05)。本研究完善了綿羊GDF9 mRNA、DNA和調控區全長序列，為進一步研究GDF9基因功能奠定了基礎。同時在不同綿羊品種中發現了G260A和-2078C>G突變，其中G260A作為潛在的有效遺傳標記可用于提高綿羊的產羔數。

綿羊；GDF9基因；mRNA；調控區；遺傳多態性

產羔數是綿羊最重要的繁殖性狀。作為轉化生長因子β超家族的一員，GDF9(Growth differentiation factor 9)通過旁分泌方式對卵泡的生長和分化起著重要作用[1-6]，并在提高綿羊產羔數中扮演著重要角色。綿羊GDF9基因位于5號染色體[7]，其包含2個外顯子和1個內含子，編碼456個氨基酸，但其成熟蛋白僅由135個氨基酸殘基組成[8]。GDF9廣泛表達于湖羊的各個組織(下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管、心、肝、脾、肺、腎)[9]。對于GDF9多態性與產羔數的關聯性研究，早在2004年，J.P.Hanrahan等[10]發現GDF9FecGH(G8)突變與愛爾蘭Cambridge和Belclare綿羊的高繁殖力密切相關。隨后發現了多個與綿羊產羔數相關的GDF9突變，包括在巴西Santa Ines綿羊中發現的FecGE突變[11-12]；在冰島Thoka綿羊中發現的FecGT突變[13]；在伊朗Moghani、Ghezel綿羊中發現的G1突變[14-15]；在中國小尾寒羊中發現的G729T突變[16]；以及最近在挪威White 和Finnish綿羊中證實與產羔數有關的FecGF(G7)突變[17-18]。由此可見GDF9基因對綿羊多羔性狀起著重要作用，然而通過查詢多個基因數據庫，發現綿羊GDF9 基因mRNA序列可能不完整，因為最長一條mRNA(NM_001142888)從起始密碼子開始，且末端無ploy(A)尾，其轉錄起始位點和終止位點仍然未知；而DNA和調控區也無試驗驗證性序列，僅為綿羊De novo基因組序列[19]，基因組在拼接過程可能出現一些錯誤，還需通過多方面驗證。同時針對該基因的多態性研究主要集中在外顯子區，對于調控區鮮見報道。

本研究應用RACE和PCR技術擴增綿羊GDF9 mRNA、DNA和調控區序列全長，并檢測其遺傳多態性，分析其與產羔數的關聯性。為尋找與綿羊產羔數相關的分子遺傳標記提供遺傳學依據。

1　材料與方法

1.1材料

選擇實驗室前期采集保存于RNA Later(Qiagen，Hilden，Germany)中的小尾寒羊卵巢組織，用于提取總RNA。384只母羊血樣來自11個綿羊品種，其中小尾寒羊(92只)采自山東鄆城縣，策勒黑羊(30只)采自新疆策勒縣，湖羊(36只)采自江蘇徐州市，多賽特羊(25只)采自內蒙古呼和浩特市，澳洲美利奴羊(30只)采自內蒙古克什克騰旗，烏珠穆沁羊(29只)采自內蒙古正藍旗，灘羊(35只)采自寧夏鹽池縣，巴音布魯克羊(30只)采自新疆和靜縣，山谷型藏羊(30只)采自西藏貢嘎縣，草原型藏羊(30只)采自西藏當雄縣，歐拉羊(17只)采自青海黃南藏族自治州，所有血樣都將用于GDF9基因遺傳多態性檢測。以上11個綿羊品種中，小尾寒羊、策勒黑羊、湖羊、澳洲美利奴屬于多羔品種，而多賽特羊、烏珠穆沁羊、灘羊、巴音布魯克羊、山谷型藏羊、草原型藏羊、歐拉羊為單羔品種，同時小尾寒羊具有產羔記錄。

1.2RNA和DNA提取

使用Trizol Reagent (Invitrogen，USA)提取卵巢組織總RNA，溶解于RNase free ddH2O中，-80℃保存。使用血液DNA提取試劑盒(天根，北京)提取血樣DNA，ddH2O溶解，置于-20 ℃備用。

1.3引物設計與合成

根據GenBank公布的綿羊GDF9基因序列(NM_001142888和NC_019462.1)，利用 NCBI Primer-BLAST軟件分別設計RACE GSP引物、DNA擴增引物和調控區擴增引物(表1)，以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1GDF9基因RACE、DNA和調控區擴增引物

Table 1Primers used for amplification of RACE，DNA，regulatory region ofGDF9 gene

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature目的片段/bpAmplifiedDNAfragment5'GSP-1GATTACGCCAAGCTTCATGGTGTGAACCGGAGAGCCATAC6512445'GSP-2GATTACGCCAAGCTTGCACTCTCCTGGTCTCTGCGGTGAC6510123'GSP-1GATTACGCCAAGCTTCACTGTTCGGCTCTTCACCCCCTGT6513133'GSP-2GATTACGCCAAGCTTTGTAAGATCGTCCCGTCACCGCAGA65719GDF9-E1-FGDF9-E1-RATGGGGAAATGTGTTCCTTGCTTCCCTCCACCCATTAACC61470GDF9-I1-FGDF9-I1-RTGAGGCTGAGACTTGGTCCTCAGCAGATCCACTGATGGAA581420GDF9-E2-FGDF9-E2-RGGGGAGAAAAGGGACAGAAGTCAATTAAAACCGCACACAGA611493TK-FTK-RCTTGCTGAAGTAGTGCGGGAAGGTAGAGGTGGCGTCTGTTGGATTT562357

1.4RACE擴增GDF9全序列

選擇小尾寒羊卵巢RNA，根據SMARTer RACE 5′/3′ Kit (Clontech Laboratories，Inc.USA)說明書合成cDNA第一條鏈。以第一條鏈為模板，利用上述設計好的GSP引物(5′GSP-2和3′GSP-2產物全覆蓋GDF9 CDS序列)，按照試劑盒操作說明，通過巢式PCR方法分別擴增獲得5′和3′RACE PCR 產物，經0.5%瓊脂糖凝膠電泳和DNA凝膠回收試劑盒(BBI，Canada)回收純化，連接至pMD-19T載體，提取質粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5GDF9基因DNA和調控區序列克隆及其多態性檢測

利用3對DNA擴增引物(GDF9-E1、I1和E2，表1)和1對調控區擴增引物(TK，表1)，根據TaKaRa ExTaq(TaKaRa，Dalian，China)試劑盒說明書，對10只小尾寒羊樣本基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經過DNA凝膠回收試劑盒(BBI，Canada)進行回收和純化，連接至pMD-19T載體，提取質粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。比對分析10只小尾寒羊序列，尋找SNP位點。

1.6SNaPshot分型

針對綿羊GDF9基因新發現的SNP位點和現有文獻報道的5個SNPs位點(FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV)，設計PCR擴增引物和SNaPshot分型引物(表2)。SNaPshot是由美國應用生物公司(ABI)開發的一種基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術，其可以快速地對多個位點進行分型，目前已經得到廣泛的使用[20-22]。按照SNaPshot分型操作說明，使用擴增引物進行PCR，擴增后的產物通過使用SAP酶(Fermentas)和ExoⅠ酶(New England Biolabs)消化清除里面的殘余引物和dNTP；以純化后的PCR產物為底物，使用SNaPshot分型引物進行延伸反應；延伸產物通過CIP酶(New England Biolabs)純化后，直接使用3730XL測序儀(ABI)檢測基因型。

1.7數據分析

對SNP分型結果統計基因型頻率、等位基因頻率。考慮到胎次對產羔數有影響，本研究配合固定效應模型[16]進行最小二乘分析，比較小尾寒羊產羔數在不同基因型之間的差異，利用 SPSS 15.0 軟件(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)的廣義線性模型(GLM)過程完成。

表2SNaPshot擴增和分型引物

Table 2The amplification and genotyping primers of SNaPshot

位點Site變異Variation擴增引物AmplificationprimerSNaPshot分型引物SNaPshotgenotypingprimerG260A(G1)[G260A]F:GTTGGAATCTGAGGCTGAGACR:GTGTTGTAGAGGTGGCGTCTGCAGCCAGATGACAGAGCTTTGC-2078C>G[C(-2078)G]F:CGCCGCCAACCCGAGTCCTTR:GCGTCCGATCTACCGGAAGTTTTTTTTTTCGCGCTGTCTCGGGGACCCCTGFecGvFecGEFecGF(G7)FecGH(G8)FecGT[C943T][T1034G][G1111A][C1184T][A1279C]F:CTGAACGACACAAGTGCTCAR:AGGAGTCTGTTAACGACAGGTTGCTGAGGGTGTAAGATCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCT-GAGTGAATACTTCAAACAGTGCTGAAGTGGGACAACTGGATTTTTTTTTTTTGCGGTCGGACATCGGTATGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCTGC-CAAGTATAGCCCTTTG

2　結　果

2.1RACE擴增GDF9 mRNA完整序列

M.DNA相對分子質量標準；1～3.5′GSP-2產物(1 095 bp)；4～6.空白對照(水)；7～10.3′GSP-2產物(929 bp)M.DL2000 DNA marker；1-3.Products of 5′GSP-2 (1 095 bp)；4-6.Blank (water)；7-10.Products of 3′GSP-2(929 bp)圖1　GDF9 5′RACE片段和3′RACE片段擴增產物電泳Fig.1　Electrophoresis of 5′RACE mRNA and 3′RACE mRNA fragments of GDF9 gene

通過5′RACE 和3′RACE，獲得了5′ 端長為1 095 bp和3′ 端長為929 bp的片段(圖1)。序列拼接和比對結果表明，GDF9 mRNA全長1 852 bp(GenBank序列號：KR063137)，包含2個外顯子，編碼區為1 368 bp，編碼456個氨基酸。與GenBank綿羊GDF9 mRNA序列(NM_001142888)相比，5′ 端多58 bp，3′ 端多185 bp(圖2)。GDF9基因編碼區兩側翼分別具有5′-UTR 58 bp(1～58 nt)和3′-UTR 432 bp(1 421～1 852 nt)。本研究僅擴增出單一條帶，表明GDF9基因在小尾寒羊卵巢中僅存在一種剪接體。

2.2GDF9基因DNA全序列擴增及其多態性分析

利用3對引物分別獲得長為470、1 420和1 493 bp的片段(圖3)，測序結果表明均為目的條帶。對3個產物片段進行拼接，獲得一條長為2 898 bp的DNA序列，序列分析表明其與NC_019462.1數據庫序列一致。進一步分析比對10只小尾寒羊序列，發現外顯子1存在一個錯義突變(G260A)(圖4)，該突變導致精氨酸變成組氨酸(CGC>CAC)，此突變為已知突變G1[10]。

2.3GDF9基因5′調控區擴增及其多態性分析

首先在小尾寒羊中通過調控區擴增引物，獲得了長為2 636 bp的擴增片段(圖5)，覆蓋起始密碼子上游調控區2 304 bp，比預測PCR產物(2 357 bp)長279 bp。為了進一步確認該結果，本研究在不同綿羊品種DNA中進行PCR擴增，結果均一致。序列分析顯示，測序序列和數據庫序列部分一致，從起始密碼子ATG到上游-1 848 bp基本一致，但在-1 848～-2 336 bp間本研究測序結果比NC_019462.1多兩個長片段：1 10和1 69 bp(圖6)。10只小尾寒羊序列比對發現，在-2 078 bp位點存在C>G突變(圖7)。

2.4GDF9在11個綿羊品種中遺傳多態性分布

對本研究發現的2個位點以及GDF9已知的功能位點進行SNP分型，發現11個綿羊品種均不含FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突變，G260A和-2078C>G突變廣泛存在于除了草原型藏羊外的其他各綿羊品種中。其中，首次發現山谷型藏羊、歐拉羊、策勒黑羊、澳洲美利奴羊和烏珠穆沁羊攜帶G260A突變(表3)。G260A包含AA、BB和AB 3種基因型，其中BB型僅存在于小尾寒羊和山谷型藏羊中。哈迪-溫伯格平衡檢驗發現該位點各基因型頻率在各群體中處于非平衡狀態。進一步分析發現，-2078C>G突變在基因型上表現出與G260A完全連鎖，在基因型頻率和等位基因頻率上二者表現完全一致。通過分析小尾寒羊產羔數與基因型的關聯性(表4)，發現BB突變純合子個體能繁殖，且產單羔，而AB雜合型的產羔數顯著高于AA型(P<0.05)。

圖2　GDF9 mRNA序列與NM_001142888序列比對Fig.2　Sequence alignment between GDF9 mRNA and NM_001142888

M.DNA相對分子質量標準；1～5.GDF9-E1產物(470 bp)；6～10.GDF9-I1產物(1 420 bp)；11～15.GDF9-E2產物(1 493 bp)M.DL2000 DNA marker；1-5.Products of GDF9-E1 (470 bp)；6-10.Products of GDF9-I1 (1 420 bp)；11-15.Products of GDF9-E2 (1 493 bp)圖3　GDF9 外顯子1、外顯子2、內含子1 PCR擴增產物電泳Fig.3　Electrophoresis of exon 1，exon 2，intron 1 of GDF9 gene

圖4　G260A基因型測序峰Fig.4　Sequencing profiles of G260A site

M.DNA相對分子質量標準；1～8.TK產物M.DL5000 DNA marker；1-8.Products of TK (2 636 bp)圖5　GDF9調控區擴增產物電泳Fig.5　Electrophoresis of regulatory region of GDF9 gene

圖6　GDF9基因調控區與序列比對Fig.6　Sequence alignment between GDF9 regulatory region and NC_019462.1

圖7　調控區突變位點-2078C>G測序峰Fig.7　Sequencing profiles of -2078C>G site

表3不同綿羊品種GDF9基因G260A和-2078C>G位點基因型頻率及等位基因頻率

Table 3Allele and genotype frequencies of G260A and -2078C>G mutations ofGDF9 gene in different sheep breeds

品種Breed個體數NumberG260A基因型頻率Genotypefrequency等位基因頻率AllelefrequencyAAABBBAB小尾寒羊Small-tailHan920.935(86)0.054(5)0.011(1)0.9620.038策勒黑羊CeleBlack300.833(25)0.167(5)0.000(0)0.9170.083湖羊Hu360.917(33)0.083(3)0.000(0)0.9580.042多賽特羊Dorset250.920(23)0.080(2)0.000(0)0.9600.040澳洲美利奴羊AustralianMerino300.733(22)0.267(8)0.000(0)0.8660.134山谷型藏羊ValleyTibetan300.733(22)0.233(7)0.033(1)0.850.150草原型藏羊PrairieTibetan301.000(30)0.000(0)0.000(0)1.0000.000巴音布魯克羊Bayinbuluke300.800(24)0.200(6)0.000(0)0.9000.100烏珠穆沁Ujumqin290.897(26)0.103(3)0.000(0)0.9480.052歐拉羊Oula170.882(15)0.118(2)0.000(0)0.9410.059灘羊Tan350.914(32)0.086(3)0.000(0)0.9570.043品種Breed個體數Number-2078C>G基因型頻率Genotypefrequency等位基因頻率AllelefrequencyCCCDDDCD小尾寒羊Small-tailHan920.935(86)0.054(5)0.011(1)0.9620.038策勒黑羊CeleBlack300.833(25)0.167(5)0.000(0)0.9170.083湖羊Hu360.917(33)0.083(3)0.000(0)0.9580.042多賽特羊Dorset250.920(23)0.080(2)0.000(0)0.9600.040澳洲美利奴羊AustralianMerino300.733(22)0.267(8)0.000(0)0.8660.134山谷型藏羊ValleyTibetan300.733(22)0.233(7)0.033(1)0.8500.150草原型藏羊PrairieTibetan301.000(30)0.000(0)0.000(0)1.0000.000巴音布魯克羊Bayinbuluke300.800(24)0.200(6)0.000(0)0.9000.100烏珠穆沁Ujumqin290.897(26)0.103(3)0.000(0)0.9480.052歐拉羊Oula170.882(15)0.118(2)0.000(0)0.9410.059灘羊Tan350.914(32)0.086(3)0.000(0)0.9570.043

表4小尾寒羊GDF9基因G260A突變不同基因型個體的產羔數

Table 4The litter size of individuals with different genotypes ofGDF9 G260A mutation in Small-tail Han sheep (mean士SD)

突變位點Mutationsite基因型Genotype個體數Number產羔數LittersizeG260AAA862.16±0.318aAB52.80±0.248b

同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Data marked with the different superscripts within the same rank differ significantly (P<0.05)

3　討　論

本研究克隆了綿羊GDF9 mRNA序列，結果與前人研究一致[8]，GDF9包含2個外顯子，一個內含子，編碼區長1 368 bp，但相比前人研究，本研究拓展了該基因的5′-UTR 58 bp和3′-UTR 185 bp，確定其轉錄起始位點位于-58 bp，這對研究GDF9基因表達調控機制具有重要作用。進一步克隆獲得2 898 bp的DNA序列和2 304 bp的調控區序列，序列比對發現DNA序列與NCBI數據庫序列一致，但是調控區序列出現了不一致的結果，在本研究的綿羊品種中擴增產物長度均為2 636 bp，比NCBI數據的序列NC_019462.1多2個長片段，由于NC_019462.1為Texel羊的序列，是否在Texel羊中存在缺失還有待進一步的證明。

目前GDF9基因在各綿羊品種中的遺傳多態性被廣泛研究，本研究發現的一個突變為G260A，該突變在2004年由J.P.Hanrahan等[10]已經對其報道，并命名為G1突變，但未將其作為效應位點。然而隨后的研究發現，G260A突變雜合子可增加Moghani和Ghezel母羊的產羔數，且突變純合子母羊表現出正常的生殖能力[14]，在97個個體中，5只G260A位點野生型的個體產雙羔(6.3%)；13只G260A位點突變雜合型個體中7只產雙羔(53.8%)；4只G260A位點突變純合型個體都能繁殖，且產單羔。最近伊朗的Afshari、Baluchi、Makui和Mehraban綿羊也表現出雜合子產羔數顯著高于野生型[15]，這表明G260A確實對綿羊繁殖力具有一定效應。當前已經在全世界多個綿羊品種中檢測到G260A位點，包括Cambridge、Belclare[10]，Moghani，Ghezel，Afshari，Baluchi，Makui,Mehraban[14，15]，Garole,Bonpala[23-24]，Chios,Karagouniki[25]，Araucano Creole[26]，德國肉用美利奴羊、巴音布魯克羊、小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊、多賽特、特克塞爾、杜泊羊[27-29]，其中僅在Moghani、Ghezel、Baluchi、Makui和Chios綿羊中檢測到突變純合子[14-15，25]。本研究首次在山谷型藏羊、歐拉羊、策勒黑羊、澳洲美利奴和烏珠穆沁羊中檢測到該位點，且在小尾寒羊和山谷型藏羊中檢測到突變純合子BB型。該突變位點主要以雜合子形式存在，這可能與之前報道的純合子突變不利于其繁殖有關[14-15]，小尾寒羊BB純合子表現出產單羔印證了這一點。本研究發現該位點雖然在多羔品種和單羔品種中不存在基因型分布差異，但是在小尾寒羊中G260A突變AB型個體產羔數顯著高于AA型(P<0.05)，說明該位點可能僅在小尾寒羊中具有一定效應，或在小尾寒羊中該位點與致因位點存在搭車效應，且在本研究中AB型個體僅為5只，該位點是否為致因位點還待進一步的研究。綜上所述，雖然G260A不能確認為致因位點，但該位點對一些綿羊多羔具有一定的效應，用于指導小尾寒羊多羔育種具有一定的意義，可作為潛在的有效遺傳標記。

本研究同時將GDF9基因多態性研究聚焦在調控區，并發現調控區新突變-2078C>G，且該位點和G260A位點完全連鎖。G260A雖改變了第87位氨基酸，但該位置并不涉及成熟蛋白的功能活性[10]。而最近的一些研究表明，調控區的突變將會直接影響基因的表達水平[30-32]，新發現的-2078C>G突變位于5′調控區，可能對GDF9基因表達具有調控作用，G260A突變的效應是否為-2078C>G引起的，這值得進一步深入研究。

4　結　論

克隆獲得綿羊GDF9基因mRNA全長序列1 852 bp、DNA序列2 898 bp和調控區序列2 304 bp，并發現了已知突變G260A(G1)和調控區新突變-2078C>G。11個綿羊品種均不含FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突變，但G260A和-2078C>G廣泛存在于除草原型藏羊外的各綿羊品種中。G260A和-2078C>G均存在3種基因型，-2078C>G在基因型上表現出與G260A完全連鎖。在小尾寒羊中，G260A位點AB型個體產羔數顯著高于AA型(P<0.05)。

[1]GALLOWAY S M，MCNATTY K P，CAMBRIDGE L M，et al.Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15) cause increased ovulation rate and infertility in a dosage-sensitive manner[J].NatGenet，2000，25(3)：279-283.

[2]DAVIS G H.Major genes affecting ovulation rate in sheep[J].GenetSelEvol，2005，37(Suppl 1)：S11-S23.

[3]KAIVO-OJA N，BONDESTAM J，KAMARAI-NEN M，et al.Growth differentiation factor-9 induces Smad2 activation and inhibin B production in cultured human granulosa-luteal cells[J].JClinEndocrinolMetab，2003，88(2)：755-762.

[4]ELVIN J A，CLARK A T，WANG P，et al.Paracrine actions of growth differentiation factor-9 in the mammalian ovary[J].MolEndocrinol，1999，13(6)：1035-1048.

[5]MCGRATH S A，ESQUELA A F，LEE S J.Oocyte-specific expression of growth/differentiation factor-9[J].MolEndocrinol，1995，9(1)：131-136.

[6]DONG J，ALBERTINI D F，NISHIMORI K，et al.Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis[J].Nature，1996，383：531-535.

[7]SADIGHI M，BODENSTEINER K J，BEATTIE A E，et al.Genetic mapping of ovine growth differentiation factor 9 (GDF9) to sheep chromosome 5[J].AnimGenet，2002，33(3)：244-245.

[8]BODENSTEINER K J，CLAY C M，MOELLER C L，et al.Molecular cloning of the ovine growth/differentiation factor-9 gene and expression of growth/differentiation factor-9 in ovine and bovine ovaries[J].BiolReprod，1999，60(2)：381-386.

[9]胡冬利，李齊發，徐業芬，等.湖羊生長分化因子9 (GDF9)基因組織表達特征、mRNA 表達水平與SNPs分析[J].農業生物技術學報，2010，18(3)：533-538.

HU D L，LI Q F，XU Y F，et al.The tissue expression profile，mRNA expression level and SNPs analysis on GDF9 gene in Hu sheep[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2010，18(3)：533-538.(in Chinese)

[10]HANRAHAN J P，GREGAN S M，MULSANT P，et al.Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovisaries)[J].BiolReprod，2004，70(4)：900-909.

[11]MELO E O，SILVA B D M，CASTRO E A，et al.A novel mutation in the Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) gene is associated，in homozygosis，with increased ovulation rate in Santa Ines sheep[J].BiolReprod，2008，78：141，371.

[12]SILVA B D M，CASTRO E A，SOUZA C J H，et al.A new polymorphism in the Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) gene is associated with increased ovulation rate and prolificacy in homozygous sheep[J].AnimGenet，2011，42(1)：89-92.

[13]NICOL L，BISHOP S C，PONG-WONG R，et al.Homozygosity for a single base-pair mutation in the oocyte-specific GDF9 gene results in sterility in Thoka sheep[J].Reproduction，2009，138(6)：921-933.

[14]BARZEGARI A，ATASHPAZ S，GHABILI K，et al.Polymorphisms in GDF9 and BMP15 associated with fertility and ovulation rate in Moghani and Ghezel sheep in Iran[J].ReprodDomestAnim，2010，45(4)：666-669.

[15]JAVANMARD A，AZADZADEH N，ESMAILIZADEH A K.Mutations in bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 genes are associated with increased litter size in fat-tailed sheep breeds[J].VetResCommun，2011，35(3)：157-167.

[16]CHU M X，YANG J，FENG T，et al.GDF9 as a candidate gene for prolificacy of Small Tail Han sheep[J].MolBiolRep，2011，38(8)：5199-5204.

[17]VAGE D I，HUSDAL M，KENT M P，et al.A missense mutation in growth differentiation factor 9 (GDF9) is strongly associated with litter size in sheep[J].BMCGenet，2013，14：1.

[18]MULLEN M P，HANRAHAN J P.Direct evidence on the contribution of a missense mutation in GDF9 to variation in ovulation rate of Finnsheep[J].PLoSOne，2014，9(4)：e95251.

[19]JIANG Y，XIE M，CHEN W，et al.The sheep genome illuminates biology of the rumen and lipid metabolism[J].Science，2014，344(6188)：1168-1173.

[20]TOUATI A，BLOUIN Y，SIRAND-PUGNET P，et al.Molecular epidemiology of mycoplasma pneumoniae：genotyping using single nucleotide polymorphisms and SNaPshot technology[J].JClinMicrobiol，2015，53(10)：3182-3194.

[21]DANIEL R，SANTOS C，PHILLIPS C，et al.A SNaPshot of next generation sequencing for forensic SNP analysis[J].ForensicSciIntGenet，2015，14：50-60.

[22]YANG L，SUN H Y，CHEN D Z，et al.Application of multiplex SNaPshot assay in measurement of PLAC4 RNA-SNP allelic ratio for noninvasive prenatal detection of trisomy 21[J].PrenatalDiag，2014，34(2)：139-144.

[23]POLLEY S，DE S，BRAHMA B，et al.Polymorphism of BMPR1B，BMP15 and GDF9 fecundity genes in prolific Garole sheep[J].TropAnimHealthPro，2010，42(5)：985-993.

[24]ROY J，POLLEY S，DE S，et al.Polymorphism of fecundity genes (FecB，FecX，and FecG) in the Indian Bonpala sheep[J].AnimBiotechnol，2011，22(3)：151-162.

[25]LIANDRIS E，KOMINAKIS A，ANDREADOU M，et al.Associations between single nucleotide polymorphisms of GDF9 and BMP15 genes and litter size in two dairy sheep breeds of Greece[J].SmallRuminantRes，2012，107(1)：16-21.

[26]PAZ E，QUINONES J，BRAVO S，et al.Identification of G1 and G8 polymorphisms of GDF9 gene in Araucano creole sheep[J].ArchMedVet，2014，46(2)：327-331.

[27]左北瑤，錢宏光，劉佳森，等.德國肉用美利奴羊BMPR-IB、BMP15和GDF9基因10個突變位點的多態性檢測分析[J].南京農業大學學報，2012，35(3)：114-120.

ZUO B Y，QIAN H G，LIU J S，et al.Detection of the 10 mutations of BMPR-IB，BMP15 and GDF9 gene in German Mutton Merino sheep[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity，2012，35(3)：114-120.(in Chinese)

[28]ZUO B Y，QIAN H G，WANG Z Y，et al.A study on BMPR-IB genes of Bayanbulak sheep[J].AsianAustralJAnim，2013，26(1)：36-42.

[29]古麗格娜，艾買提·買買提，於建國，等.7種綿羊和4種山羊GDF9基因G1突變檢測[J].中國草食動物科學，2015，35(4)：1-4.

GULIGENA，AIMAITI·MAIMAITI，YU J G，et al.Detection of the G1 mutation of the GDF9 gene in seven sheep and four goat breeds[J].ChinaHerbivoresScience，2015，35(4)：1-4.(in Chinese)

[30]PARK C K，LEE S H，KIM J Y，et al.Expression level of hTERT is regulated by somatic mutation and common single nucleotide polymorphism at promoter region in glioblastoma[J].Oncotarget，2014，5(10)：3399-3407.

[31]MAHAJAN M，YADAV S K.Gain of function mutation in tobacco MADS box promoter switch on the expression of flowering class B genes converting sepals to petals[J].MolBiolRep，2014，41(2)：705-712.

[32]HUANG J，DANG R，TORIGOE D，et al.Genetic variation in the GDNF promoter affects its expression and modifies the severity of Hirschsprung’s disease (HSCR) in rats carrying Ednrb mutations[J].Gene，2016，575(1)：144-148.

(編輯郭云雁)

Cloning and Genetic Polymorphism Analysis of mRNA，DNA and Regulatory Region of OvineGDF9 Gene in 11 Breeds

PAN Zhang-yuan，HE Xiao-yun，LIU Qiu-yue，HU Wen-ping，WANG Xiang-yu，GUO Xiao-fei，CAO Xiao-han，DI Ran*，CHU Ming-xing*

(KeyLaboratoryofFarmAnimalGeneticResourcesandGermplasmInnovationofMinistryofAgriculture，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The aim of this study was to clone the mRNA，DNA and regulatory region sequence of ovineGDF9 gene，detect its genetic polymorphism in 11 sheep breeds，and search for the molecular genetic markers related to sheep litter size.The RACE and PCR technologies were used to clone full-length sequence of ovineGDF9 gene，and SNaPshot was performed to detect the polymorphisms ofGDF9 gene in 11 breeds.A 1 852 bp full-length mRNA of ovineGDF9 gene (GenBank No.：KR063137) was obtained，which contains 58 bp 5′-UTR and 432 bp 3′-UTR.In addition，2 898 bp of DNA sequence and 2 304 bp of regulatory region sequence were amplified.Compared with the sequence of NC_019462.1，the result had 2 more fragments in regulatory region.The genetic polymorphism analysis showed that a known mutation G260A (G1) and a novel mutation -2078C>G within regulatory region were identified.The genotyping results showed that 11 sheep breeds were free ofFecGE，FecGH，FecGT，FecGF，FecGVmutations，while the G260A and -2078C>G were widespread in all sheep except Prairie Tibetan sheep.G260A contained 3 genotypes AA，BB and AB，but the BB genotype only presented in Small-tail Han sheep and Valley Tibetan sheep.-2078C>G also included 3 genotypes，in which the genotype and allele frequencies were exactly the same with G260A.It seems that -2078C>G was complete linkage with G260A.Association analysis in Small-tail Han sheep showed that the litter size of individuals with AB genotype was significantly higher than that of AA genotype (P<0.05).We improved the mRNA，DNA and regulatory region sequences of ovineGDF9，which provided a foundation for further functional study ofGDF9 gene.Meanwhile，G260A and -2078C>G mutations were found in different sheep breeds，and G260A site could be a potential genetic marker for improving litter size in sheep.

sheep；GDF9 gene；mRNA；regulatory region；genetic polymorphism

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.005

2015-12-14

中國農業科學院科技創新工程(ASTIP-IAS13)；國家肉羊產業技術體系專項(CARS-39)；國家自然科學基金項目(31472078)；國家轉基因科技重大專項(2016ZX08009-003-006；2016ZX08010-005-003)；內蒙古自治區戰略性新興產業發展專項資金計劃

潘章源(1986-)，男，江西贛州人，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：pzq170450077@163.com

狄 冉，副研究員，E-mail：dirangirl@163.com；儲明星，研究員，E-mail：mxchu@263.net

S826；S821.2

A

0366-6964(2016)08-1555-10