中國部分地區鴨、鵝攜帶四種病毒狀況的調查與分析

劉　洋，王傳彬，霍斯琪，翟新驗，辛盛鵬，劉玉良，韓　雪，張　倩，楊衛錚，顧小雪

(中國動物疫病預防控制中心，北京 102618)

?

中國部分地區鴨、鵝攜帶四種病毒狀況的調查與分析

劉洋，王傳彬，霍斯琪，翟新驗，辛盛鵬，劉玉良，韓雪，張倩，楊衛錚，顧小雪*

(中國動物疫病預防控制中心，北京 102618)

為了解中國部分地區鴨、鵝的病毒攜帶情況，作者于2014年11月，從安徽、浙江、福建、廣東、廣西5省的多個表觀健康鴨、鵝群中采集樣品1 931份，采用熒光定量PCR對鴨瘟病毒(DPV)、鴨甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)進行檢測。結果顯示，DTMUV陽性率為1.2%，DPV陽性率為0.3%；其余兩種病毒均未檢出。結果表明，臨床表觀健康的鴨、鵝可攜帶鴨坦布蘇病毒和鴨瘟病毒，而且，序列分析結果顯示，所攜帶的毒株與臨床分離的相應致病性毒株相似性較高，提示在水禽疫病傳播過程中，表觀健康但帶毒的動物可能成為疫病傳播的風險點。

鴨瘟病毒；鴨甲型肝炎病毒1型；小鵝瘟病毒；鴨坦布蘇病毒；流行病學調查

中國是世界上水禽飼養最多的國家，但由于養殖技術落后，飼養數量和飼養密度的不斷增加以及各省市間頻繁的活禽調運，導致水禽疫病愈發嚴重，出現“老病未除(如20世紀50年代即出現的鴨瘟、鴨病毒性肝炎以及小鵝瘟)、新病又起(如2010年以來我國大范圍暴發的鴨坦布蘇病毒病)”的復雜局面。另一方面，水禽疫病的相關研究大多集中于對發病動物或群體的零星報道，而對水禽整體疫病的流行情況不甚了解，尤其對健康鴨群或鵝群中相關疫病的感染情況更鮮有報道。因此，為初步了解我國水禽群體中相關疫病的隱性感染狀況，作者在我國水禽養殖主要產區的多個省市，分別從水禽養殖的不同環節中采集表觀健康鴨鵝的泄殖腔拭子、組織及環境樣本，進行鴨瘟病毒、鴨甲型肝炎病毒1型、小鵝瘟病毒、鴨坦布蘇病毒的分子流行病學調查，以期為進一步制定全面的監測計劃、采取檢疫措施和科學防控水禽疫病提供參考。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

5×MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit和AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit購自ABI公司。GoTaq Probe qPCR Master Mix購自Promega公司。pEASY-T3 Cloning Kit購自全式金公司。7500實時熒光定量PCR系統購自ABI公司，TissueLyser Ⅱ組織研磨儀購自QIAGEN公司。

1.2樣品采集和信息調查

選擇我國水禽養殖主產區的安徽、浙江、福建、廣東和廣西五省進行樣品采集，每省選擇2個縣(市、區)，根據實地情況采集鴨鵝規模場、活禽交易市場、屠宰場和自然村。每一采樣地采集表觀健康水禽咽喉/泄殖腔拭子30份，環境樣品5份，屠宰場另加采鴨肝脾組織20份。拭子樣品采集后放入含有雙抗的生理鹽水中，所有樣品置于冰盒盡快送往實驗室進行處理，或置于-70 ℃備用。在采集樣品的同時，對采樣地的水禽種類、品種，養殖規模，養殖方式，既往病史，疫苗免疫情況等方面進行問卷調查。

1.3病毒核酸提取

取肝、脾組織樣品0.1 g于2 mL平底離心管中，加1粒鋼珠和1 mL PBS(pH7.2)，放入TissueLyser II組織研磨Kingfisher Flex全自動磁珠提取純化系統儀中研磨5 min，10 000 r · min-1離心1 min后取上清，與拭子液和環境樣品液一同進行核酸提取。按照5×MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit使用說明書，采用Kingfisher Flex全自動磁珠提取純化系統提取病毒核酸。最后將病毒核酸洗脫至50 μL無菌去離子水中，-20 ℃保存備用。

1.4引物設計和熒光定量PCR擴增

根據國標GB/T22332-2008中的DPV目的片段和GPV保守基因VP3全長設計熒光定量PCR引物及探針；DTMUV和DHAV-1的熒光定量PCR引物及探針(表1)分別根據S.Li等[1]和M.Yang等[2]的報道進行設計。引物和探針由上海基康生物技術有限公司合成。

DPV和GPV熒光定量PCR反應體系為2×GoTaq Probe qPCR Master Mix 10 μL，10 pmol·L-1相應上下游引物對0.8 μL，10 pmol·L-1探針0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL，病毒核酸模板2 μL，混勻后置于7500實時熒光定量PCR系統中進行擴增。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。出現典型的擴增曲線時，判定為DPV或GPV感染陽性。

DTMUV和DHAV-1熒光定量RT-PCR反應體系為2×RT-PCR反應液 10 μL，10 pmol· L-1相應上下游引物對0.8 μL，10 pmol·L-1探針0.4 μL，25×RT-PCR酶混合液0.8 μL，滅菌去離子水6 μL，病毒核酸模板2 μL，混勻后置于7500實時熒光定量PCR系統中進行擴增。反應條件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環。出現典型的擴增曲線時，判定為DTMUV或DHAV-1感染陽性。

1.5數據分析

熒光定量PCR檢測結果為陽性則判定該動物為DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV陽性動物，只要被檢場/村檢出1只DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV陽性動物則判定該場/村為陽性場/村。計算各省被檢樣品的DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV陽性率及所有被檢中小規模場、活禽交易市場、屠宰場和自然村的場/村陽性率和個體陽性率。

個體陽性率=陽性動物數/被檢動物總數×100%

場/村陽性率=陽性場(村)數/被檢場(村)數×100%

1.6陽性樣品特異性片段擴增及序列分析

根據曹貞貞[3]報道測定DTMUV全長的19對引物，以及李昌主等[4]報道的DPVTK基因全長引物，分別選擇有代表性的DTMUV和DPV陽性樣品進行RT-PCR和PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳確定為目的片段后，連接到pEASY-T3載體中，轉化大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1，挑取單個克隆進行PCR鑒定。每個片段選取三個陽性克隆送北京英濰捷基公司測序。

利用Lasergene軟件，對所得序列進行拼接，并與已發表的DTMUV及DPV代表株進行比對，采用MEGA軟件對核苷酸相似性較高的序列進行進化樹分析。

2　結　果

2.1調查水禽和樣品信息

共采集13個規模鴨場、8個規模鵝場、15個自然村、13個活禽交易市場和3個屠宰場的1 199份鴨咽喉/泄殖腔拭子、411份鵝咽喉/泄殖腔拭子、242份環境樣品和79份鴨肝脾組織樣品，共計1 931份。所調查規模場以飼養地方鴨鵝品種為主，多以自繁自養和活禽購入方式進行繁育，其中水養場11個，旱養場7個，水養旱養結合的場3個。規模鴨場中蛋鴨場4個，肉鴨場9個。所調查活禽市場、自然村中有櫻桃谷、番鴨、半番鴨等肉鴨品種和麻鴨等蛋鴨品種。

2.2水禽群中的DTMUV、DPV、DHAV-1和GPV感染情況

安徽、浙江、福建、廣東和廣西五省的1 931份樣品檢測結果顯示，有9.6%的水禽場/村檢出DTMUV陽性樣本，個體陽性率為1.2%(23/1 931)，陽性樣本來自廣東和廣西；有1.9%水禽場/村檢出DPV陽性樣本，個體陽性率為0.3%(4/1 520)，陽性樣本來自廣東；未檢出DHAV-1和GPV，且無混合感染的情況(表2)。

2.2.1不同來源的DTMUV和DPV感染情況在調查的2個規模鵝場、2個活禽市場和1個屠宰場的水禽中檢出DTMUV陽性樣本，其場內陽性率分別為46.7%、2.9%、1.4%、1.8%、19.4%，自然村散養戶的水禽中沒有檢出DTMUV陽性樣本(表3)。根據問卷調查，DTMUV陽性屠宰場的鵝可能來源于同地區的規模鵝場。在調查的1個活禽市場的鴨中檢出DPV陽性樣本，其場內陽性率為28.6%(表3)。

2.2.2不同樣品的DTMUV和DPV感染情況鴨咽喉/泄殖腔拭子、鵝咽喉/泄殖腔拭子中的DTMUV檢出率分別為0.2%和5.1%，鴨組織和環境樣本中沒有檢出DTMUV陽性樣本(表3)。該結果顯示，DTMUV的鵝源陽性樣本多于鴨源陽性樣本。鴨咽喉/泄殖腔拭子中的DPV檢出率為0.3%，鴨組織和環境樣本中也沒有檢出DPV陽性樣本(表3)。

2.3陽性樣品序列分析

選取廣東省DTMUV陽性規模鵝場的陽性鵝咽喉/泄殖腔拭子G23進行該病毒的全基因組測序，由于拭子樣品病毒含量有限，3′端未能測通，已獲得的序列拼接后共10 881 nt，提交至GenBank，獲得序列號KT239021。經比對其核苷酸序列與2011年分離自廣西蛋鴨毒株GX_2011(GenBank：KC990542)[5]相似性相似性最高，可達98.9%(10 757/10 882)；與已報道全序列的鵝源毒株相比，與2012年首次報道的鵝源毒株ZJ GH-2(GenBank：JQ314465)[6]相似性最高，為98.4%(10 709/10 882)。已獲得的序列中包含一個完整CDS，長10 278 nt，編碼3 425 aa，采用MEGA6.0構建基于該CDS核苷酸的遺傳進化樹，由圖1可見，G23與我國多地及泰國的分離株親緣關系較近，與馬來西亞的分離株則相對較遠，其中與2013年報道的分離自廣西鴨的GX_2011和2012年報道的分離自廣東番鴨的WJ-1株親緣關系最近，位于同一分支內，相似性達98.4%以上。

選取廣東省DPV陽性活禽市場的陽性鴨咽喉/泄殖腔拭子92D36對其TK基因進行測序，結果顯示所測得的1 275 bp與1962年分離的CV株(GenBank：JQ673560)相似性最高，達99.9%(1 274/1 275)。

3　討　論

表觀健康的水禽亦可攜帶禽流感病毒[7]、新城疫病毒[8]，但攜帶其他水禽相關疫病病原(如鴨瘟病毒和小鵝瘟病毒)的情況則鮮有研究。我國華東、華南地區水網密集，一直以來都是我國水禽養殖的主要區域，但也是水禽疫病多發的地區。如鴨瘟、鴨病毒性肝炎和小鵝瘟等在我國已流行有五十多年的疫病近幾年在華東、華南地區也頻有發生[9]。新發水禽疫病也多從這些地區始發，2010年在我國首次暴發的水禽新疫病鴨坦布蘇病毒病就是從浙江等省最先出現，而后迅速蔓延至我國華北、東北等省市。因此，了解該區域表觀健康水禽攜帶病毒的情況，對科學防控水禽疫病顯得尤為重要。

本研究中作者對安徽、浙江、福建、廣東和廣西五省采集的表觀健康水禽拭子、鴨組織及環境樣本通過熒光定量PCR/熒光定量RT-PCR檢測鴨瘟病毒、鴨甲型肝炎病毒1型、小鵝瘟病毒以及鴨坦布蘇病毒。結果顯示，表觀健康鴨可從拭子樣品中檢出鴨瘟病毒，這與國外文獻報道的健康水禽可攜帶鴨瘟病毒[10]一致。推測是由于鴨瘟病毒能持續感染水禽，并可長期經糞便和口分泌物進行排毒所致。鴨瘟屬于我國二類疫病，列入疫情報告系統，但尚無國家主動監測計劃和相應的防控技術規范。該病目前尚無特效治療藥物，因此免疫預防顯得尤為重要。已批準的鴨瘟疫苗有鴨瘟活疫苗、鴨瘟活疫苗(雞胚化弱毒株)、鴨瘟滅活疫苗和鴨瘟滅活疫苗(AV1221株)四種，免疫效果良好[9]。但從調查問卷反饋的情況來看，免疫情況不容樂觀。首先，規模鴨場仍存在不免疫的情況。本次調查的13個規模鴨場中進行鴨瘟病毒免疫的僅有8個，有38%的鴨場尚不進行免疫。其次，自然村散養戶對該病的免疫意識較差。本次調查共涉及15個自然村，其中養鴨的有44戶散養戶，無一免疫，增加了該病傳播的風險。本研究中檢出的鴨瘟病毒陽性樣品來自廣東三水區某活禽市場，所采集的鴨亦未免疫，因此也排除了免疫后排毒的可能，提示存在野毒感染。

圖1　G23(框內)與多株DTMUV病毒CDS核苷酸同源進化樹分析Fig.1　Bayesian phylogeny of the CDS nucleotide sequence of G23 (showed in frame) and DTMUV reference strains

鴨坦布蘇病毒自2010年出現以來，已廣泛流行于我國水禽養殖的多個省市[11]，目前已從鴨、番鴨、鵝、雞[12]以及麻雀[13]、鴿子[14]和蚊子[15]中發現該病毒，也有研究從養鴨場工作人員的血清和口腔拭子中檢出相應抗體和病毒RNA[16]。由于該病毒主要感染鴨，因此研究多集中于發病鴨群，對表觀健康動物帶毒的情況尚無相關研究。本研究結果表明，表觀健康的鴨鵝亦可攜帶鴨坦布蘇病毒，同時鵝坦布蘇病毒的攜帶率高于鴨，推測這可能與不同動物宿主對該病毒的易感性存在差異有關。有文獻指出從病鴨泄殖腔拭子中也可分離到病毒，但本研究中采用陽性拭子液接種9日齡鴨胚和8日齡雞胚，盲傳三代均未見死亡，推測是由于表觀健康鴨鵝拭子的帶毒量有限，不足以造成胚體死亡所致。此外，本次研究中，陽性率較高的規模場和屠宰場來自廣東同一個地區，根據流行病學調查問卷顯示，屠宰場動物來自規模場，說明表觀健康但攜帶病原的水禽具備在環境中傳播病毒的能力。另外，鴨坦布蘇病毒在這五年間并未出現明顯的變異，而且分離株無明顯地域差異。本研究中表觀健康鴨鵝所攜帶的毒株與臨床分離的致病毒株相似性較高，尤其與兩廣地區的流行株親緣關系更近，綜合以上條件，這類水禽在不同地區調運過程中極易造成病毒的快速傳播，應引起動物疫病防控部門的注意。

鴨甲型肝炎病毒1型和小鵝瘟病毒在我國流行已有50年之久，但至今仍未得到有效控制，每年還會造成雛鴨和雛鵝死亡，對水禽養殖業的發展影響極大[9]。這兩種疫病主要感染幼齡動物，死亡率較高，青年和成年水禽感染后多不表現臨床癥狀，但病毒可在體內不斷繁殖進而不斷排毒。本研究中所有樣品均未檢出鴨甲型肝炎病毒1型和小鵝瘟病毒，提示所檢禽群可能并未感染這兩種病毒。

4　結　論

表觀健康的鴨鵝亦可攜帶鴨坦布蘇病毒和鴨瘟病毒，且其所攜帶的毒株與臨床分離的相應致病株相似性較高。提示在疫病傳播過程中，應有針對性地開展水禽疫病主動監測，防止由于表觀健康動物攜帶病原進而造成疫病的擴散傳播。

[1]LI S，LI X，ZHANG L，et al.Duck Tembusu virus exhibits neurovirulence in BALB/c mice[J].VirolJ，2013，10：260.

[2]YANG M，CHENG A，WANG M，et al.Development and application of a one-step real-time Taqman RT-PCR assay for detection of duck hepatitis virus type1[J].JVirolMethods，2008，153(1)：55-60.

[3]曹貞貞.鴨出血性卵巢炎的病因分析[D].北京：中國農業大學，2013.

CAO Z Z.Etiological analysis of duck hemorrhagic ovaritis[D].Beijing：China Agricultural University，2013.(in Chinese)

[4]李昌主，韓先杰，鄒玲，等.鴨瘟病毒AV1221株TK基因的克隆與序列分析[J].青島農業大學學報(自然科學版)，2007，24(3)：162-164.

LI C Z，HAN X J，ZOU L，et al.Cloning and sequence analysis of TK gene of duck plague virus AV1221 strain[J].JournalofQingdaoAgriculturalUniversity(NaturalScience)，2007，24(3)：162-164.(in Chinese)

[5]YU K，SHENG Z Z，HUANG B，et al.Structural，antigenic，and evolutionary characterizations of the envelope protein of newly emerging Duck Tembusu Virus[J].PLoSOne，2013，8(8)：e71319.

[6]YUN T，ZHANG D，MA X，et al.Complete genome sequence of a novel flavivirus，duck tembusu virus，isolated from ducks and geese in China[J].JVirol，2012，86(6)：3406-3407.

[7]DENG G，TAN D，SHI J，et al.Complex reassortment of multiple subtypes of avian influenza viruses in domestic ducks at the Dongting Lake Region of China[J].JVirol，2013，87(17)：9452-9462.

[8]陳露，萬洪全，宋紅芹，等.表觀健康鵝群新城疫病毒的分離及生物學特性[J].中國獸醫學報，2008，28(3)：239-242.

CHEN L，WAN H Q，SONG H Q，et al.Biological characterization of Newcastle disease viruses isolated from apparently healthy goose flocks[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2008，28(3)：239-242.(in Chinese)

[9]顧小雪，劉洋，馬蘇，等.我國水禽疫病的流行情況及防控對策[J].中國家禽，2015，37(16)：1-5.

GUO X X，LIU Y，MA S，et al.Prevalence and control measures on waterfowl diseases in China[J].ChinaPoultry，2015，37(16)：1-5.(in Chinese)

[10]胡勇，鄒忠，劉志剛，等.鴨腸炎病毒研究進展[A].第五屆中國水禽行業發展大會會刊[C].赤峰：2013.219-223.

HU Y，ZOU Z，LIU Z G，et al.Review of duck enteritis virus[A].Fifth Waterfowl Industry Development Conference in China[C].Chifeng：2013.219-223.(in Chinese)

[11]LIU P，LU H，LI S，et al.Duck egg drop syndrome virus：an emerging Tembusu-related flavivirus in China[J].SciChinaLifeSci，2013，56(8)：701-710.

[12]LIU M，CHEN S，CHEN Y，et al.Adapted Tembusu-Like virus in chickens and geese in China[J].JClinMicrobiol，2012，50(8)：2807-2809.

[13]TANG Y，DIAO Y，YU C，et al.Characterization of a Tembusu virus isolated from naturally infected house sparrows (Passer domesticus) in Northern China[J].TransboundEmergDis，2013，60(2)：152-158.

[14]LIU P，LU H，LI S，et al.Genomic and antigenic characterization of the newly emerging Chinese duck egg-drop syndrome flavivirus：genomic comparison with Tembusu and Sitiawan viruses[J].JGenVirol，2012，93(Pt 10)：2158-2170.

[15]TANG Y，DIAO Y，CHEN H，et al.Isolation and genetic characterization of a tembusu virus strain isolated from mosquitoes in Shandong，China[J].TransboundEmergDis，2015，62(2)：209-216.

[16]TANG Y，GAO X，DIAO Y，et al.Tembusu virus in human，China[J].TransboundEmergDis，2013，60(3)：193-196.

(編輯白永平)

Epidemiologic Investigation of Four Viruses Carried by Ducks and Geese in China

LIU Yang，WANG Chuan-bin，HUO Si-qi，ZHAI Xin-yan，XIN Sheng-peng，LIU Yu-liang，HAN Xue，ZHANG Qian，YANG Wei-zheng，GU Xiao-xue

(ChinaAnimalDiseaseControlCentre，Beijing100126，China)

To investigate the prevalence of duck plague virus (DPV)，duck hepatitis virus type 1 (DHAV-1)，goose parvovirus (GPV) and duck Tembusu virus (DTMUV) carried by duck and goose flocks in China，1 931 samples were collected from clinically healthy ducks and geese in Anhui，Zhejiang，Fujian，Guangdong and Guangxi provinces in November，2014.The four viruses above were detected by real-time PCR.DTMUV and DPV were detected in these specimens with a positive rate of 1.2% and 0.3%，respectively，while no DHAV-1 or GPV was detected.Our results demonstrated the presence of DTMUV and DPV in clinically healthy duck and goose flocks，furthermore，the two viruses carried by duck and goose shared high similarities at the nucleic acid level with the corresponding clinical pathogenic strains.These findings highlight the necessity of active surveillance for healthy waterfowls，in order to prevent transmission of viruses.

duck plague virus；duck hepatitis virus type 1；goose parvovirus；duck Tembusu virus；epidemiologic investigation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.011

2016-02-29

農業技術試驗示范項目(2130106)；科技基礎性工作專項(2013FY113300)

劉洋(1985-)，女，山西大同人，獸醫師，博士，主要從事水禽疫病及禽類細菌病的防控工作，E-mail：lysonna@163.com

顧小雪，E-mail：gxxjackie@163.com

S858.35.3

A

0366-6964(2016)08-1610-08