外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活MAPK信號通路的分析

孫曉林，杜方原，劉淑英，2

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018；2.農業部動物臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018)

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外源性綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白激活MAPK信號通路的分析

孫曉林1，杜方原1，劉淑英1，2

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018；2.農業部動物臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018)

旨在深入探究外源性綿羊肺腺瘤病毒(exJSRV)囊膜蛋白(Env)的致病機制，通過組織病理學觀察和免疫組織化學染色，檢測病肺的病理特征以及Env、EGFR和MAPK信號通路中p-Erk1/2和p-p38的陽性表達區，通過Western blot檢測Erk1/2和p38在病肺中的磷酸化水平。轉染重組表達質粒pcDNA 4/myc-His /exJSRV-env到A549細胞中，通過Western blot檢測Erk1/2和p38的磷酸化水平。通過CCK-8法檢測轉染重組表達質粒的A549細胞的增殖活力。免疫組化結果顯示：JSRV Env蛋白主要表達于病肺組織的肺泡上皮細胞和腫瘤細胞，EGFR在病肺組織中過表達于肺泡上皮細胞，脫落的腫瘤細胞及間質細胞中，而在健康綿羊肺中只是少量表達于肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞中，p-Erk1/2和p-p38在病肺組織中主要表達于肺泡上皮細胞和腫瘤細胞，EGFR、p-Erk1/2和p-p38的陽性表達區均與Env蛋白的陽性表達區一致。Western blot結果顯示：病肺中p-Erk1/2和p-p38的磷酸化水平均極顯著高于健康肺組織，轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549細胞中p-Erk1/2和p-p38的表達量均極顯著高于對照組細胞，說明exJSRV-env確實激活了A549細胞的MAPK通路。而CCK8結果顯示：轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549細胞增殖活力顯著高于對照組細胞，說明exJSRV-env可能是通過激活的EGFR/MAPK通路促進A549細胞的惡性增殖，進而促使腫瘤的發生。本研究為進一步探索綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的致病機制奠定了基礎。

外源性綿羊肺腺瘤病毒；囊膜蛋白；MAPK信號轉導通路；細胞增殖

綿羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)是綿羊肺腺瘤病(OPA)的病原，OPA是一種傳染性綿羊肺癌[1]。由于組織培養體系的缺乏，JSRV/OPA的研究一直在病毒培養方面受到阻礙。就以往的研究來看，感染JSRV的綿羊病料(肺液)是傳染性OPA的唯一來源[2]。顯而易見，對于JSRV/OPA體系的研究只能建立在OPA病例的基礎上[3]。該病的特點是腫瘤細胞產生大量分泌物導致肺部積聚肺液，OPA腫瘤起源于肺泡Ⅱ型上皮細胞或Clara細胞[4-5]。

之前已經有研究表明，JSRV的腫瘤形成機制是由腫瘤的Env蛋白激活涉及轉染的信號通路蛋白激酶[6-7]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)與腫瘤有著密切的關系，常常在腫瘤的發生發展過程中，伴隨著EGFR調控的異常，如EGFR的過表達或EGFR的突變等。有研究者發現，有50%～70%的肺癌、結腸癌和乳腺癌等上皮細胞癌都有EGFR的過度激活。通過抑制EGFR、磷酸化EGFR及其下游的信號通路，往往可以抑制腫瘤的生長、增殖和轉移等[8]。而EGF及其受體是MAPK信號轉導通路的主要啟動者。目前已經發現EGFR主要激活兩條MAPK介導的信號轉導通路：MAPK/ERK和MAPK/JNK通路[9]，MAPK/ERK、MAPK/JNK和MAPK/p38是MAPK重要的三種類型[6]。ERK1/2在腫瘤中起到的作用主要是通過活化的p-ERK1/2與其他信號途徑中的效應分子或核轉錄因子相互作用后，促進細胞的增殖和惡性轉化[11]。有大量的研究表明，p38 MAPK信號通路對腫瘤細胞的生長和增殖起著綜合作用，而p38 MAPK蛋白激酶的抑制劑可以抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導凋亡[12]。也有研究發現，通過抑制p38 MAPK信號通路的活性，會導致A549細胞的浸潤和表達受到抑制，提示p38 MAPK可以促進腫瘤的浸潤和轉移[10]。而N.Maeda等[13]發現，p38抑制劑會增強JSRV Env的轉化作用，并推測p38可能是通過活化PP1/2A，使MEK1/2去磷酸化，繼而降低ERK1/2的活性，來抑制H/N-Ras-MEK-MAPK通路的活性。

基于以上研究基礎，筆者通過組織病理學觀察檢測病肺的病理特征，通過免疫組織化學檢測病肺組織中Env、EGFR、以及p-Erk1/2和p-p38的陽性表達區，通過觀察各自的陽性信號表達區來定位蛋白發揮效應的靶細胞，并通過Western blot檢測p-Erk1/2和p-p38在病肺中的磷酸化水平，以及將重組表達質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉入人肺癌細胞A549細胞中，檢測p-Erk1/2和p-p38的表達量，判斷是否A549細胞受到Env的誘導，激活了MAPK通路，最后通過CCK8法檢測細胞增殖活力，推測細胞增殖活力的改變是否受到MAPK通路激活的影響，為進一步探索綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的致病機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物與樣品的采集

自然感染綿羊肺腺瘤病料于內蒙古四子王旗采集，健康綿羊肺由內蒙古呼和浩特市屠宰場提供。

1.2主要試劑

A549細胞(國家細胞資源共享平臺購買)；pcDNA4/myc-His真核表達載體由本實驗室保存；pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達質粒由本實驗室構建；E.coliDH5α感受態細胞(天根生化科技(北京)有限責任公司)；Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo公司)；LipofectamineTMLTX & PLUS 轉染試劑(Invitrogen公司)；限制性內切酶NotⅠ和BamHⅠ，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限責任公司]；去內毒素質粒抽提純化試劑盒(Promega公司)；高糖DMEM培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)和Opti-MEM培養基(Gibco公司)；兔抗Env51-394多克隆抗體為本實驗室制備；兔抗His，Anti-EGFR antibody ab2430(Abcam公司)；β-Actin(13E5) Rabbit mAb，p44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5)，Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)XP?Rabbit mAb，p38 MAPK Antibody，Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9)XP?Rabbit mAb(Cell Signaling公司)，Pierce?Goat Anti-Rabbit IgG，(H+L)，Peroxidase Conjugated(Thermo公司)，ECL STAR特超敏顯色試劑盒(北京碧云天公司)。

1.3肺組織病理切片制備及觀察

將肺組織置10%福爾馬林溶液中固定12 h后，沖洗12 h，依照常規操作進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘片以及HE染色和免疫組化，中性樹膠封片后，烤片12 h，最后在光學顯微鏡下觀察組織切片。

1.4肺組織信號通路免疫組化檢測

同上制片，選擇相應試劑進行免疫組化染色，中性樹膠封片后，烤片12 h，最后在光學顯微鏡下觀察組織切片。

1.5肺組織信號通路Western blot檢測

將病料從-80 ℃取出，放在液氮中研磨，加入組織裂解液后超聲波破碎，提取總蛋白質，取蛋白質溶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質上樣量為每孔30 μg，并通過半干轉法轉移至PVDF濾膜上，將膜放入Western blot封閉液中，于搖床上封閉2 h。之后用TBST清洗5次，每次5 min，一抗4 ℃過夜孵育，TBST清洗5次，每次5 min，二抗于搖床上室溫孵育1 h。TBST清洗5次，每次5 min，ECL 孵育1 min，曝光1 min后觀察結果。

1.6最佳轉染效率測定

轉染前24h將A549細胞傳代至60mm皿中，加入含10%FBS無雙抗的完全培養基3mL，于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養。待細胞長滿至80% 時按照LipofectamineTMLTX&PLUS轉染試劑說明書轉染重組質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env。分組試驗梯度為500ng組質粒添加LTX2、3、4、5、6、8和10μL，轉染48h后分別做RT-PCR和Westernblot檢測最佳轉染效率。RT-PCR引物為本試驗根據exJSRV的全基因序列(No.AF105220)，利用PrimerPrimer5.0軟件，在env基因區域設計一對exJSRV-env的引物(預期擴增產物大小1 848bp)。引物上下游分別加入NotⅠ和BamHⅠ的酶切位點。上游引物(env-F)：5′-CGCGGATCCACACCATGGCGAAGCGCCG-3′，下游引物(env-R)：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGGGTCGTCCCCCGC-3′，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.7pcDNA4/myc-His/exJSRV-env瞬時轉染A549細胞

根據測定的最佳轉染條件分別轉染重組質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env和pcDNA4/myc-His空質粒到A549細胞，為后續試驗做準備。

1.8細胞轉染后exJSRV-envmRNA轉錄的檢測

收集各組瞬時轉染48 h的A549細胞，提取細胞總RNA，利用分光光度計檢測RNA的純度，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳在成像儀上檢測RNA的完整性，確定可用后將所提RNA反轉錄成cDNA后進行PCR擴增，產物進行凝膠電泳檢測。PCR引物及反應條件均與“1.6”相同。

1.9Western blot檢測Env蛋白A549細胞中的表達

提取各組細胞總蛋白質，取蛋白質溶液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白質上樣量為每孔20 μg，并通過半干轉法轉移至PVDF濾膜上，將膜放入Western blot封閉液中，于搖床上封閉2 h。之后用TBST清洗5次，每次5 min，一抗4 ℃過夜孵育。TBST清洗，二抗于搖床上室溫孵育1 h。TBST清洗5次，每次5 min，ECL 孵育1 min，曝光1 min后觀察結果。

1.10Western blot檢測信號通路蛋白在A549細胞中的表達

1.11CCK8法檢測細胞體外增殖能力

將轉染pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的細胞及未轉染的A549細胞鋪板于96孔板中，每孔1 000個細胞，每組設5個復孔，每孔加100μL完全培養基，37 ℃，5%CO2培養，鋪5個板子。每天同一時間加入10μLCCK8，37 ℃孵育1h，用酶標儀測定其在450nm處的吸光值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制生長曲線。

2　結　果

2.1肺組織病理切片觀察與免疫組織化學檢測

取自然感染的綿羊病肺組織分別做HE染色以及免疫組化檢測，免疫組化檢測一抗采用本實驗室制備的Env多克隆抗體，結果顯示，病肺肺泡壁增寬，有大量的肺泡上皮細胞腫瘤性增生，肺組織中充斥大量腺瘤灶及類腺瘤區，腺瘤灶周圍有大量脫落的瘤細胞及巨噬細胞等典型的綿羊肺腺瘤病理特征(圖1A)。健康綿羊肺的肺泡壁較薄，多成圓形或卵圓形，未見腫瘤灶(圖1B)。FAN等[3]已經證明JSRVEnv足夠引起細胞轉化，并且exJSRV-env的主要靶細胞為肺泡上皮細胞。因此作者做了病肺免疫組化的JSRVEnv檢測，發現肺泡上皮細胞及腫瘤細胞中有大量的陽性表達(圖1C)。驗證了JSRVEnv的靶細胞為肺泡上皮細胞這一點。而健康綿羊肺組織則未見表達(圖1D)。

2.2肺組織信號通路免疫組化檢測

取自然感染的綿羊病肺組織，免疫組化檢測EGFR在病肺組織中的表達，發現其過表達于肺泡上皮細胞，脫落的腫瘤細胞及間質細胞中(圖2A)，而在健康綿羊肺中只是少量表達于肺泡上皮細胞(圖2B)和支氣管上皮細胞中(未展示)，這與JSRVEnv的靶細胞一致，而JSRVEnv是引起細胞轉化的主要因素，因此有可能是JSRVEnv激活了病肺細胞中EGFR的表達。而作為陰性對照，一抗用PBS代替的病肺組織(圖2C)，以及正常綿羊肺組織(圖2D)均未見陽性信號的表達。接著檢測EGFR下游通路MAPK通路中兩個重要蛋白Erk1/2和p38的磷酸化水平，正常綿羊肺組織及一抗用PBS取代的病肺組織均為陰性對照。發現p-Erk在肺泡上皮細胞及腫瘤細胞中均有大量表達(圖3A、B)，而正常綿羊肺組織(圖3C、D)未檢測到表達。p-p38也大量表達于肺泡上皮細胞中(圖3E、F)，正常綿羊肺組織未檢測到表達(圖3G、H)，其中一抗用PBS代替的病肺組織(圖3I、J)，以及正常綿羊肺組織(圖3K、L)均未見陽性信號表達。免疫組化結果顯示：不同腫瘤結節間標記的強度不同，當用不同濃度的一抗時都保持不變，說明這種變化與一抗的濃度無關，而是與p-Erk1/2、p-p38在不同腫瘤中的濃度有關。JSRV感染的肺組織中，IHC表明OPA-N肺組織中Env陽性信號的細胞為肺泡上皮細胞和腫瘤細胞，而p-Erk1/2、p-p38陽性信號也主要表達于肺泡上皮細胞和腫瘤細胞，因此Env與p-Erk1/2和p-p38的陽性表達區一致，并且主要定位于細胞核和細胞質。而JSRVEnv是引起細胞轉化的主要誘因，因此也有可能是JSRVEnv激活了病肺組織中p-Erk1/2和p-p38的表達。對于大部分結節來說，p-Erk1/2、p-p38標記的陽性腫瘤細胞在同一視野的不同結節中陽性信號的表達強度不同，在一些結節中，100%腫瘤細胞都有標記。標記的強度由弱到強變化。另外，有些陽性信號標記在支氣管區的間質細胞，成纖維細胞，和一些單獨的細支氣管上皮細胞(未展示)。少量的間質細胞是p-Erk1/2、p-p38陽性信號。總體來講，這些數據表明，JSRV感染的肺組織細胞表現出了EGFR的激活，以及其下游MAPK通路中p-Erk1/2、p-p38的活化。

2.3肺組織信號通路Westernblot檢測

經Westernblot檢測，自然感染OPA的病肺和健康綿羊肺組織均有Erk1/2和p38的表達，而自然感染OPA病肺的p-Erk和p-p38的表達量都極顯著高于健康綿羊肺組織的表達量(圖4、圖5)。

2.4pcDNA4/myc-His/exJSRV-env最佳轉染效率測定

結果顯示，48h后加入不同LTX濃度的質粒，JSRV-env均有mRNA水平的表達(圖6)，而JSRVEnv蛋白的表達差異極顯著，加入4μLLTX的蛋白表達量要極顯著高于其他試驗組的蛋白表達量(圖7)，因此最終選取500ng的pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達質粒中加入4μLLTX為最佳轉染濃度。

A.腫瘤肺組織HE染色，200×；B.健康肺組織HE染色，100 ×；C.腫瘤肺組織免疫組化染色，200×；D.健康肺組織免疫組化染色，200×A.Neoplastic lung tissue of sheep HE staining，200×；B.Normal lung tissue of sheep HE staining，100×；C.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，200×；D.Normal lung tissue of immunostaining，200×圖1　病肺組織化學染色結果Fig.1 Result of ovine pulmonary adenocarcinoma

A.腫瘤肺組織免疫組化檢測；B.健康肺組織免疫組化檢測；C.腫瘤肺組織免疫組化染色；D.健康肺組織免疫組化染色A.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining staining；B.Normal lung tissue of sheep immunostaining；C.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，；D.Normal lung tissue of immunostaining圖2　EGFR在自然感染OPA病肺組織中的表達分布(200×)Fig.2　Neoplastic lung tissue of OPA-N sheep immunostaining for EGFR(200×)

A、E、I.腫瘤肺組織免疫組化，100×；B、F、J.腫瘤肺組織免疫組化，400×；C、G、K.正常綿羊肺組織免疫組化，100×；D、H、L.正常綿羊肺組織免疫組化，400×A，E，I.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining staining，100×；B，F，J.Neoplastic lung tissue of sheep immunostaining，400×；C，G，K.Normal lung tissue of sheep immunostaining，100×；D，H，L.Normal lung tissue of immunostaining，400×圖3　p-Erk1/2和p-p38在自然感染OPA病肺組織中的表達分布Fig.3　Neoplastic lung tissue of OPA-N sheep immunostaining For p-Erk and p-p38

1.健康綿羊肺組織；2.自然感染OPA病肺1.Normal sheep lung；2.OPA-N sheep lung圖4　Western blot檢測信號通路在肺中的蛋白表達Fig.4　Western blot analysis of protein expressions in the lung

Control.健康綿羊肺組織；OPA-N.自然感染OPA肺組織；**.P<0.01Control.Normal sheep lung；OPA-N.Natural infection OPA sheep lung；**.P<0.01圖5　肺中通路蛋白質表達量的變化Fig.5　Activation of p-Erk1/2 and p-p38 in sheep lung

2.5pcDNA4/myc-His/exJSRV-env轉染A549細胞后目的基因的檢測

轉染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達質粒的細胞在2 000 bp下方均擴增出目的條帶，未轉染的細胞和轉染空質粒的細胞沒有擴增出目的條帶(圖8)。

2.6Western blot檢測JSRV Env的表達情況

Western blot結果顯示：轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細胞和轉染空質粒pcDNA4/myc-His的細胞均有His標簽蛋白的表達，未轉染的A549細胞沒有表達，而轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細胞有Env蛋白的表達，轉染空質粒pcDNA4/myc-His的細胞和未轉染的A549細胞沒有表達(圖9)。

M.DL5000 DNA相對分子質量標準；1～8.分別為pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 真核表達質粒500 ng，加LTX 2、3、4、5、4、6、8、10 μLM.DL5000 DNA marker；1-8.A549 transfected with 500 ng pcDNA4/myc-His/exJSRV-env and LTX 2，3，4，5，4，6，8，10 μL圖6　RT-PCR檢測pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達質粒轉染A549細胞48 h后mRNA轉錄Fig.6　Identification of exJSRV-env expressed in A549 cells after 48 h by RT-PCR

1～8.分別為pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 真核表達質粒500 ng，加LTX 2、3、4、5、4、6、8、10 μL1-8.A549 transfected with 500 ng pcDNA4/myc-His/exJSRV-env and LTX 2，3，4，5，4，6，8，10 μL圖7　Western blot檢測pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達質粒轉染A549細胞48 h后蛋白質表達Fig.7　Identification of exJSRV-env expressed in A549 cells after 48 h by Western blot

M.DL5000 DNA相對分子質量標準；1.未轉染的A549細胞；2.轉染pcDNA4/myc-His空質粒的A549細胞；3.exJSRV-env 基因擴增產物M.DL5000 DNA marker；1.A549；2.A549 transfected with pcDNA4/myc-His；3.A549 transfected with pcDNA4/myc-His/exJSRV-env圖8　RT-PCR檢測exJSRV-env在A549細胞中的表達Fig.8　Identification of exJSRV-env expressed in A549 cells by RT-PCR

1.未轉染的A549細胞；2.轉染空質粒pcDNA4/myc-His的細胞；3.轉染重組質粒pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 的細胞1.A549；2.A549 transfected with pcDNA4/myc-His；3.A549 transfected with pcDNA4/myc-His/exJSRV-env圖9　Western blot檢測exJSRV-env在A549細胞的表達Fig.9　Western blot analysis of exJSRV-env expression in A549

2.7信號通路蛋白表達量的檢測

經Western blot檢測，轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細胞和未轉染的細胞均有Erk1/2和p38的表達，轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細胞的p-Erk1/2的表達量極顯著高于未轉染的細胞，而轉染重組表達質粒pcDNA4/myc-His-exJSRV-env的A549細胞的p-p38的表達量很高，未轉染的細胞未檢測到表達(圖10、圖11)。

1.未轉染的A549細胞；2.轉染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 的細胞1.A549；2.A549 transfected with pcDNA4/myc-His/exJSRV-env圖10　Western blot檢測信號通路在細胞中的蛋白表達Fig.10　Western blot analysis of exJSRV-env expression in A549 cells

Control.未轉染的空細胞對照組；exJSRV-env.轉染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env 的細胞組；**.P<0.01Control.Normal sheep lung；OPA-N.Natural infection OPA sheep lung；**.P<0.01圖11 A549細胞中通路蛋白質表達量的變化Fig.11 Activation of p-Erk1/2 and p-p38 in A549 cells

2.8CCK8法檢測細胞體外增殖能力

CCK8檢測數據經SPSS軟件分析，結果顯示，轉染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env的A549細胞的增殖活力顯著高于對照組細胞(P<0.05)(圖12)。

*.P<0.05圖12　轉染后細胞增殖曲線Fig.12　Cells growth curve after the transformation

3　討　論

最近的研究發現，自然感染OPA的腫瘤細胞和表達JSRV的肺模型中均相對于未感染的肺或肺模型有更高比例的Ki-67的表達[14]，而Ki-67作為標記細胞增殖狀態的抗原，表明JSRV Env在自然感染的肺和肺模型中的表達均可以促進細胞增殖。盡管JSRV Env促進轉染的具體機制還不十分明確，但是有學者[14-17]認為它激活了一系列調控細胞增殖分化的信號通路。EGFR表達于正常上皮細胞表面，而在一些腫瘤細胞中常過表達，EGFR的下游信號通路為Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/ mTOR通路。N.M.Linnerth-petrik等[18]提出，Env誘導的腫瘤中有EGFR在Tyr1068位點的磷酸化，并激活了Akt，而Akt是抗凋亡因素中的關鍵激酶，因此，Env有可能通過這條通路來逃避凋亡。而MAPK信號轉導通路在肝癌等很多腫瘤細胞[11]中均檢測到活化，MAPK信號通路可以通過影響動物細胞內基因的轉錄和調控，從而影響細胞的增殖、分化以及凋亡，p38 MAPK和ERK/MAPK為其重要的兩條途徑，p38和Erk1/2也與細胞的分裂和增殖息息相關[19]。p38抑制劑會促進ERK1/2的激活，甚至細胞的增殖活力都顯著升高[13，20]。

本研究通過免疫組化檢測EGFR在病肺組織中的表達，發現其過表達于肺泡上皮細胞，脫落的腫瘤細胞及間質細胞中，這與JSRV Env蛋白的陽性表達區一致。這為進一步研究MAPK通路在JSRV Env誘導腫瘤產生中的作用奠定了基礎。而免疫組織化學檢測病肺中p-Erk1/2和p-p38兩個磷酸化蛋白的表達發現，p-Erk1/2的陽性表達區也是Env和EGFR的陽性表達區，并且自然感染OPA的腫瘤與健康綿羊肺相比，p-Erk1/2和p-p38的表達水平均極顯著增高。通過Western blot檢測發現轉染pcDNA4/myc-His/exJSRV-env真核表達質粒的A549細胞中Erk1/2和p38兩個蛋白的磷酸化水平均極顯著高于對照組細胞，與組織中蛋白的表達一致，說明在轉染了重組表達質粒后激活了MAPK/ERK通路及MAPK/p38通路。采用CCK8法發現轉染的exJSRV-env的細胞增殖活性顯著高于正常培養的A549細胞，說明exJSRV-env具有一定促進A549細胞增殖的能力。因此根據作者的試驗結果推測，JSRV Env感染的細胞中，激活了EGFR/MAPK通路，其中MAPK/ERK通路的激活會抑制細胞的增殖，并抵抗細胞凋亡，而MAPK/p38的激活會抑制MAPK/ERK通路，p-p38的表達量較強又高于p-Erk1/2的表達量，因此在它們的綜合作用下，促進了腫瘤細胞的增殖和惡性轉化。而具體EGFR、p38、以及Erk1/2是怎樣在共同調控并交互作用的同時激活下游的相關轉錄因子，誘導綿羊肺腺瘤的發生發展我們還在繼續做進一步研究。

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(編輯白永平)

Recombinant Plasmid pcDNA4/myc-His/exJSRV-env Transiently Transfect A549 Cells and Detect the Activation of MAPK Signal Transduction Pathway

SUN Xiao-lin1，DU Fang-yuan1，LIU Shu-ying1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China；2.KeyLaboratoryofClinicalDiagnosisandTreatmentTechnologyinAnimalDiseaseofMinistryofAgriculture，Huhhot010018，China)

In order to explore the pathogenesis of exJSRV Env，by the means of the pathology observation and immunohistochemistry，we detected the pathological characteristics and the positive regions of Env，EGFR，p-Erk1/2 and p-p38 in OPA (ovine pulmonary adenomatosis) sheep lung.Then we detected the relative expressions of p-Erk1/2 and p-p38 in sheep lung and in A549 cells after transiently transfecting recombinant plasmid pcDNA4/myc-His/exJSRV-env by Western blot.Finally we detected the proliferation activity of the cells with recombinant plasmid by CCK-8.Immunohistochemistry results revealed that infected lung cells expressed Env in alveolar epithelial cells and tumor cells；EGFR in alveolar epithelial cells，tumor cells slipping off and interstitial cells but less expressed in alveolar epithelial cells and bronchial epithelial cells in normal sheep lung；p-Erk1/2 and p-p38 in alveolar epithelial cells and tumor cells.Western blot results showed that the activation of p-Erk and p-p38 in OPA sheep lung were higher than normal sheep lung.The relative expressions of p-Erk and p-p38 in the A549 cells with recombinant plasmid were higher than control cells.And CCK8 showed that the proliferation activity of the cells with recombinant plasmid were higher than the control cells.We conclude that exJSRV Env activated EGFR/MAPK signal transduction pathway in A549 cells，and possibly promoted the malignant cell proliferation by this pathway and tumorigenesis.We provide a platform for the pathogenesis of JSRV Env.

exJSRV；envelope protein；MAPK signal transduction pathway；cell proliferation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.017

2016-03-28

國家自然基金(31360597)；內蒙古科技廳應用研究項目(201502070)；內蒙古草原英才創新團隊項目(20151031)

孫曉林(1989-)，女，內蒙古呼倫貝爾人，博士生，主要從事動物生殖內分泌與病毒病理學的研究，E-mail：732121783@qq.com

劉淑英，教授，博士生導師，E-mail：liushuying_imau@126.com

S852.659.3

A

0366-6964(2016)08-1658-09