鴨源雞桿菌整合子及其與耐藥性的相關性分析

彭志鋒，高冬生，劉紅英，楊　霞，趙　軍，王新衛，李永濤，陳　陸，常洪濤，王川慶

(河南農業大學禽病研究所，鄭州 450002)

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鴨源雞桿菌整合子及其與耐藥性的相關性分析

彭志鋒#，高冬生#，劉紅英，楊霞，趙軍，王新衛，李永濤，陳陸，常洪濤，王川慶*

(河南農業大學禽病研究所，鄭州 450002)

為了解鴨源雞桿菌的整合子及其與耐藥性之間的關系，運用PCR方法檢測鴨源雞桿菌分離株攜帶1、2、3類整合子的情況，采用K-B法測定61株鴨源雞桿菌對13種抗菌藥的敏感性，并分析其整合子與耐藥性的關聯性。結果顯示，所有參試菌株對克林霉素、諾氟沙星、鏈霉素有耐藥性的菌株比例均不低于88.52 %(54/61)。19株鴨源雞桿菌攜帶1類整合子，陽性率為31.15%，且此類菌株的耐藥種數均≥3；在耐藥種數≥5的菌株中，整合子陽性菌的比例(78.95%)顯著高于整合子陰性菌的比例(28.57%，P<0.01)。本試驗首次研究了鴨源雞桿菌中整合子的分布情況。參試菌株僅攜帶1類整合子，且普遍存在多重耐藥性；1類整合子可能在鴨源雞桿菌多重耐藥性的形成中發揮一定作用。

鴨源雞桿菌；整合子；耐藥性

雞桿菌屬是巴氏桿菌科中相對較新的屬[1]，該屬包括數個種[2]。然而似乎只有溶血性鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis，G.anatis)在家禽中普遍流行，其感染往往造成蛋雞的輸卵管炎和腹膜炎[3-4]。隨著細菌耐藥性的不斷增加，導致抗生素臨床治療效果不佳。研究顯示巴氏桿菌科細菌存在普遍的耐藥性[5-6]，而鴨源雞桿菌耐藥性的報道尚不多見[7-8]。

細菌整合子是具有捕獲和表達外源基因功能的遺傳單位，在常見病原菌中普遍存在，且與多重耐藥性關系密切[9-11]。包括鴨源雞桿菌在內的巴氏桿菌科細菌整合子的研究鮮有報道[12]。為了解鴨源雞桿菌的耐藥性、整合子分布情況以及兩者的關系，作者首次檢測61株鴨源雞桿菌分離株的整合子，以及對13種抗菌藥的敏感性，并分析鴨源雞桿菌整合子與耐藥性之間的相關性，旨在了解鴨源雞桿菌的耐藥機制，并為臨床篩選有效抗生素提供依據。

1　材料與方法

1.1菌株

61株鴨源雞桿菌來源于河南、陜西、山西、山東四省患腹膜炎、輸卵管炎的蛋雞，由本實驗室分離、保存[13]；質控菌ATCC27090和ATCC25922購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.2試劑

藥物紙片標準品購自杭州天和藥物技術開發公司，包括青霉素(P)、氨芐西林(AM)；諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVF)；克林霉素(CM)；鏈霉素(S)、妥布霉素(TM)、卡那霉素(KAN)、慶大霉素(GM)；四環素(TE)；頭孢噻呋(CEF)和利福平(RA)共13種(7類)抗菌藥物；PCR擴增試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3引物

檢測1、2和3類整合酶基因的特異性引物參考以往的報道[14]，預期擴增產物的大小分別為553、789和600 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.41、2和3類整合酶基因的PCR檢測

煮沸法提取細菌DNA。按文獻[14]所述分別進行三類整合酶基因的擴增，擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照分析。

1.5藥物敏感性試驗

采用K-B法測定61株鴨源雞桿菌對13種抗菌藥物的敏感性。由于還沒有針對鴨源雞桿菌的操作標準和判定標準，因此本研究參照NCCLS(2013)中巴氏桿菌的標準進行操作和結果判斷。

1.6DNA序列分析

PCR擴增的整合酶基因片段測序后通過GenBank中Genome BLAST進行基因同源性分析。

1.7統計學分析

分析鴨源雞桿菌整合子與耐藥性的關系，并用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。

2　結　果

2.1整合子檢出情況

僅部分菌株含有1類整合酶基因；所有菌株未發現2和3類整合子。

1類整合酶基因PCR產物片段大小與預期相符(圖1)。經測序和同源性分析，與GenBank中1類整合酶基因相似性接近或等于100%。61株鴨源雞桿菌中僅19株擴增出1類整合酶基因，陽性率為31.15%。所有參試菌株的2和3類整合酶基因檢測均為陰性。

2.261株鴨源雞桿菌的耐藥表型

K-B法檢測結果表明參試菌株均表現多重耐藥，未見對所有菌株敏感的藥物；61株鴨源雞桿菌對下列藥物有耐藥性的菌株比例均在80%以上：克林霉素(CM，93.44%)、諾氟沙星(NOR，93.44%)、鏈霉素(S，88.52%)、環丙沙星(CIP，83.61%)、卡那霉素(KNA，80.33%)；而對慶大霉素(GM，18.03%)、頭孢噻呋(CEF，22.95%)和利福平(RA，11.47%)的耐藥率均低于23%(圖2)。

2.3鴨源雞桿菌1類整合子與耐藥性的關系

對每類受試藥物逐一繪制參試鴨源雞桿菌的耐藥譜，所分別統計的1類整合子陽性和陰性菌株耐藥譜分布情況見圖3。結果顯示61株鴨源雞桿菌普遍存在耐藥性；1類整合子陽性菌株的耐藥種數為3～7，其中78.95%(14/19)的菌株耐藥5～7種。1類整合子陰性菌株的耐藥種數為1～6，其中僅28.57%(12/42)菌株耐藥5～6種，遠低于整合子陽性菌株的比例，兩者差異極顯著(P<0.01)。在耐藥種數≥5的菌株中，整合子陽性菌株所占比例遠高于整合子陰性菌株(圖3)。耐藥種數≥4的鴨源雞桿菌共43株(70.5%)，其中整合子陽性菌7株。耐藥種數≤3的鴨源雞桿菌共18株(29.5%)，其中整合子陽性菌株2株。隨著整合子陽性菌株比例的降低，參試菌株的耐藥種數也相應減少，其差異極顯著(P<0.01)。

M．DL2000 DNA相對分子質量標準；+.陽性對照；-.陰性對照；1～61.鴨源雞桿菌1類整合酶基因PCR產物M．DL2000 DNA marker；+.Positive control；-.Negative control；1-61.PCR products of intI1 gene of G.anatis isolates圖1　61株鴨源雞桿菌1類整合酶基因PCR擴增產物電泳Fig.1　The results of PCR amplification of intI1gene of 61 G.anatis isolates

AM.氨芐西林；CIP.環丙沙星；CM.克林霉素；P.青霉素；NOR.諾氟沙星；KAN.卡那霉素；GM.慶大霉素；S.鏈霉素；TM.妥布霉素；TE.四環素；LVF.左氧氟沙星；CEF.頭孢噻呋；RA.利福平AM.Ampicillin；CIP.Ciprofloxacin；CM.Clindamycin；P.Penicillin；NOR.Norfloxacin；KAN.Kanamycin；GM.Gentamicin；S.Streptomycin；TM.Tobramycin；TE.Tetracycline；LVF.Levofloxacin；CEF.Cephalothin；RA.Rifampicin圖2　61株鴨源雞桿菌耐藥率分析Fig.2　Drug resistance rate of G.anatis strains(n=61)

虛線框顯示耐藥種數≥5時，1類整合子陽性菌(n=19)的耐藥菌株比例均大于整合子陰性菌(n=42)The dotted box indicated when the number of antibiotic category≥5，Drug resistance rates of class 1 integron positive strains (n=19) are greater than that of class 1 integron negative strains (n=42)，respectively圖3　鴨源雞桿菌多重耐藥及其1類整合子分布Fig.3　Multidrug resistance and class 1 integron distribution of G.anatis isolates

除了頭孢噻呋和利福平以外，61株鴨源雞桿菌對其他11種抗菌藥物的耐藥性菌株比例均為1類整合子陽性菌株高于陰性菌株，但只有對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥性，1類整合子陽性和陰性鴨源雞桿菌的差異顯著(P<0.01)(表1)。

表161株鴨源雞桿菌耐藥性與1類整合子的關系

Table 1Association between antibiotic resistance and class 1 integron in 61G.anatisstrains

抗菌藥物Antibacterialagents耐藥菌株比例/%Rateofresistancestrains整合子陽性菌株Integronpositivestrains整合子陰性菌株IntegronnegativestrainsP值Pvalue環丙沙星CIP100(19)76.19(32)<0.05諾氟沙星NOR100(19)90.48(38)>0.05左氧氟沙星LVF78.95(15)9.52(4)<0.01卡那霉素KAN94.74(18)73.81(31)>0.05慶大霉素GM26.32(5)14.29(6)>0.05鏈霉素S94.74(18)85.71(36)>0.05妥布霉素TM47.37(9)33.33(14)>0.05氨芐西林AM84.21(16)64.29(27)>0.05青霉素P89.47(17)73.81(31)>0.05頭孢噻呋CEF15.79(3)26.19(11)>0.05利福平RA10.53(2)11.90(5)>0.05克林霉素CM100(19)90.48(38)>0.05四環素TE78.95(15)54.76(23)>0.05

整合子陽性菌株總數為19，整合子陰性菌株總數為42

The amounts of integron positive strains and integron negative strains are 19 and 42，respectively

3　討　論

3.1隨著抗生素的大量使用，細菌耐藥性造成細菌感染的治療越來越復雜。本研究中，作者選取了禽類生產中經常用到的13種抗菌藥物，并檢測了61株鴨源雞桿菌對其耐藥情況，而且首次鑒定了整合子在鴨源雞桿菌中的分布情況，并分析了其與多重耐藥性的關系。本研究參試菌株普遍存在多重耐藥性，以往的研究中也有類似結果[7-8]。鴨源雞桿菌對克林霉素、諾氟沙星、環丙沙星和卡那霉素的多重耐藥性提示，使用這些藥物治療該菌引起的雞輸卵管炎、腹膜炎可能不會收到預期效果。高耐藥率可能與臨床大量使用這些藥物有直接關系[15]；因此建議使用耐藥率較低的慶大霉素和頭孢噻呋等藥物防治該病，同時勿過量使用抗生素，以減緩細菌耐藥性的產生[16]。本文參試菌株耐藥譜與巴氏桿菌科其他細菌的情況不盡相同[17-18]，這可能與不同地區的用藥習慣不同有關。本研究為防治該病的臨床合理用藥提供了科學依據。

3.2整合子是具有捕獲和表達外源基因功能的遺傳單位，存在于細菌質粒或染色體上，通過自身編碼的整合酶來獲取外源基因并使之表達[19]。整合子捕獲、整合和表達耐藥盒，引起耐藥基因在同種或不同菌屬間傳播，從而使細菌耐藥性得以廣泛擴散[20-21]。革蘭陰性菌中研究比較多的是1、2、3類整合子，其中以1類整合子最為常見[10，22-23]。目前，有關巴氏桿菌科細菌整合子的信息極少，本研究首次報道了整合子在鴨源雞桿菌中的分布，并分析了其與多重耐藥的關系。結果表明，所有參試菌株均不存在2、3類整合子，31.15%的菌株含有1類整合子。由于參試菌株數量限制，需要進一步檢測更多菌株，才能確定2、3類整合子在鴨源雞桿菌中的存在狀態。

綜合本研究的各項數據可以看出，整合子與鴨源雞桿菌的多重耐藥有一定的關系。整合子陽性菌的耐藥種數為3～7，且耐藥5～7種的菌株比例為78.95%(14/19)；整合子陰性菌的耐藥種數為1～6，且耐藥5～6種的菌株僅28.57%(12/42)，兩者差異極顯著(P<0.01)；耐藥種數為5、6和7時，整合子陽性菌株的耐藥率均高于整合子陰性菌株(圖3)。特別是在耐藥種數為5的所有菌株中，其整合子陽性菌株比例明顯高于陰性菌株比例且具有統計學意義，提示整合子可能與鴨源雞桿菌多重耐藥存在一定的關聯性。這與某些學者對其他細菌的研究結果一致[10，24-25]。

3.361株鴨源雞桿菌對11種抗菌藥物的耐藥率，均為整合子陽性菌株高于陰性菌株，但只有對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥性差異具有統計學意義(P<0.01)，這表明鴨源雞桿菌對環丙沙星和左氧氟沙星的抗性可能與整合子的出現直接相關；對其他9種抗菌藥的耐藥率差異不顯著(P>0.05)，暗示參試細菌對此9種抗菌藥的耐藥表型差異與整合子無直接相關性。出現這一結果可能因為耐藥表型差異不完全是由整合子主導的，而是由其他未檢測的耐藥因素共同作用的結果[7-8]。整合子與細菌多重耐藥性的確切關系有待后續鑒定耐藥基因后，統計分析其與耐藥表型的相關性來確定。

4　結　論

河南、陜西、山西、山東鴨源雞桿菌分離株攜帶1類整合子；鴨源雞桿菌普遍存在多重耐藥性，且1類整合子可能在其多重耐藥性的形成中發揮一定作用。

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(編輯白永平)

GallibacteriumanatisIntegron and Its Correlation with the Drug Resistance

PENG Zhi-feng#，GAO Dong-sheng#，LIU Hong-ying，YANG Xia，ZHAO Jun，WANG Xin-wei，LI Yong-tao，CHEN Lu，CHANG Hong-tao，WANG Chuan-qing*

(InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

The aim of the present study was to confirm existence of the integrons inGallibacteriumanatis(G.anatis)isolates and the role of integrons in multidrug resistance.The integrons class 1，2 and 3 inG.anatisisolates were detected by PCR amplification for the first time.The sensitivity of 61G.anatisstrains was tested against 13 kinds of antibiotics by Kirby-Bauer method.The correlation between multidrug resistance and integrons was analyzed.The results showed that drug resistance rates of allG.anatisisolates to clindamycin，norfloxacin and streptomycin were above 88.52%.No less than three kinds of drugs were resisted for 19G.anatisstrains which carrying class 1 integron.Among strains resisting more than five kinds of drugs，the proportion of the class 1 integron positive (78.95%) was significantly higher than that(28.57%)of class 1 integron negative strains(P<0.01).It was the first time，to our knowledge，that the distribution of intergons inG.anatishad been investigated. Only class 1 integron was found and multidrug resistance was very common inG.anatisisolates in this study.Class 1 integron might play an important role in the formation of multiple drug resistance phenotype ofG.anatisstrains.

Gallibacteriumanatis；antibiotic resistance；integrons

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.019

2016-01-21

國家自然科學基金(31302090)；河南省高校科技創新團隊與支持計劃資助項目(14IRTSHN015)

彭志鋒(1982-)，男，河南周口人，博士生，主要從事動物傳染病發病機制及防制研究，E-mail:zfpeng2006@126.com；高冬生，男，(1985-)，河南新密人，碩士，主要從事動物傳染病發病機制及防制研究。#彭志鋒和高冬生同為第一作者

王川慶，男，教授，博導， E-mail:wchuanq@163.com

S852.612

A

0366-6964(2016)08-1676-06