二至丸對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量的影響

趙雪瑩，韓偉麗，徐　丹，高長玉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

?

·實驗研究·

二至丸對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量的影響

趙雪瑩，韓偉麗，徐丹，高長玉*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

目的觀察二至丸對D-半乳糖致衰老模型大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量的影響，探討二至丸抗氧化的作用機制。方法采用D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠，測定大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量。結(jié)果二至丸各治療組較模型對照組大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量顯著降低。結(jié)論二至丸能夠提高機體的抗氧化能力，可能與其能夠降低體內(nèi)活性氧含量有關(guān)，從而延緩機體的衰老進程。

二至丸；D-半乳糖；線粒體呼吸鏈復(fù)合物；Ⅰ、Ⅳ;衰老

二至丸出自明·王三才《醫(yī)便》，該方僅由女貞子、旱蓮草2味草藥組成，可滋補肝腎，臨床上有治療頭目眩暈、視物昏花、腰酸背痛、須發(fā)早白等功效[1]。本實驗采用D-半乳糖腹腔注射法復(fù)制衰老大鼠模型，在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察二至丸對衰老大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ含量的影響，探討二至丸對抗氧化系統(tǒng)的影響及其延緩衰老的作用。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物清潔級Wistar大鼠60只(雌雄各半)，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供[SCXK(吉)-2011-0004]，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)在黑龍江省中醫(yī)藥基礎(chǔ)重點實驗室，溫度(22±2)℃、濕度40%～70%、光照周期12 h、自由進食進水。

1．1．2實驗藥物與制備D-半乳糖:美國Sigma藥品公司，批號:0637。二至丸:女貞子1 000 g，旱蓮草1 000 g，蜂蜜120 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)門診部；女貞子、旱蓮草研磨粉碎，過100目篩備用[2]。兩生藥混合根據(jù)實驗需要分別配置成高、中、低濃度的藥液(0．324、0．162、0．081 g/mL)，4 ℃保存。維生素E:青島雙鯨藥業(yè)有限公司，國藥準字:H37023084，批號:130102，購自哈爾濱恒瑞新藥特藥店。金龍魚大豆油(特?zé)捯患?，哈爾濱益海嘉里糧油食品工業(yè)有限公司。將維生素E溶于大豆油中，濃度0．013 5 g/mL，常溫保存。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號:201403)。

1．1．3實驗儀器酶標儀，鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司；KDC-40低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1．2實驗方法

1．2．1實驗分組將60只Wistar大鼠(雌雄各半)隨機分成6組:空白組、模型組、維生素E組、二至丸高、中、低劑量組，每組10只(雌雄各半)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食進水。

1．2．2造模方法采用D-半乳糖復(fù)制大鼠亞急性衰老模型[3]。將5 000 mg D-半乳糖溶于500 mL生理鹽水中，按照100 mg/(kg·d)的劑量給大鼠(空白組除外)腹腔注射給藥[4]，空白組則給等量的生理鹽水，1次/d。每周稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)節(jié)給藥劑量，連續(xù)給藥8周，實驗過程中大鼠自由進食進水。

1．2．3給藥方法造模成功后，各給藥組從第9周開始每日分別灌胃給藥，空白組和模型組分別灌胃等體積的生理鹽水。二至丸各劑量組給藥濃度分別為:低劑量組0．81 g/kg，中劑量組1．62 g/kg，高劑量組3．24 g/kg；維生素E組0．027 g/kg。每周給大鼠稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。連續(xù)給藥10周。

1．3指標測定末次給藥后，將大鼠禁食不禁水24 h后斷頭取材。取大鼠腦組織適量(剩余腦組織保存于-80 ℃待用)，加生理鹽水以1∶9比例于冰上勻漿，應(yīng)用KDC-40低速離心機離心3 000 r/min，離心20 min，取組織勻漿上清用于指標測定。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ含量測定方法參照試劑盒說明書。

2　結(jié)果

2．1二至丸對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ含量的影響見表1。

組 別劑量/(g/kg)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ空白組 —1.93±0.57 模型組 —4.36±1.06△△維生素E組 0.0272.25±0.52##二至丸低劑量組0.8103.06±0.78#△二至丸中劑量組1.6202.26±0.59##二至丸高劑量組3.8402.07±0.55##

注:與模型組比較，#P﹤0．05，##P﹤0．01；與高劑量組比較，△P﹤0．05，△△P﹤0．01

2．2二至丸對D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ含量的影響見表2。

組 別劑量/(g/kg)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ空白組 —1.40±0.76 模型組 —4.93±1.28△△ 維生素E組 0.0271.81±0.88## 二至丸低劑量組0.8103.47±1.58##△二至丸中劑量組1.6202.79±1.19## 二至丸高劑量組3.8402.05±1.05##

注:與模型組比較，#P﹤0．05，##P﹤0．01；與高劑量組比較，△P﹤0．05，△△P﹤0．01

3　討論

研究表明，90%以上的氧氣在線粒體中經(jīng)呼吸鏈被還原。線粒體消耗的氧約有2%～5%用于生成H2O2及O2-，二者均為活性氧，如果不能被及時清除，則很快經(jīng)Fenten反應(yīng)生成活性氧自由基，對機體有害。氧自由基一旦聚集積聚，則造成與ATP酶相偶聯(lián)的共同完成線粒體合成ATP的能量系統(tǒng)代謝異常，線粒體產(chǎn)能不足，不能滿足其呼吸鏈的正常功能，致使線粒體呼吸鏈復(fù)合物無法正常代謝進而產(chǎn)生堆積[5]。在線粒體呼吸鏈復(fù)合物中,復(fù)合物Ⅰ是體內(nèi)能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成ATP的橋梁,而復(fù)合物IV極脆弱且不穩(wěn)定，易受到活性氧自由基的攻擊，細胞色素氧化酶結(jié)合電子的能力在復(fù)合物IV受到破壞的情況下就會減弱，導(dǎo)致ATP合成減少，呼吸產(chǎn)能過程出現(xiàn)不可逆的損傷[6]。

線粒體呼吸鏈不僅受到活性氧自由基的影響，還與線粒體DNA氧化損傷有關(guān)。當(dāng)機體出現(xiàn)衰老時，線粒體功能逐漸減退，呼吸鏈復(fù)合物的含量在各組織中均有不同程度的升高(尤其是腦組織)。當(dāng)呼吸鏈功能逐漸下降不能滿足氧化磷酸化的需求時，就會產(chǎn)生過多的活性氧自由基，造成線粒體DNA氧化損傷；線粒體DNA氧化損傷后，又可引起呼吸鏈相關(guān)蛋白酶亞單位合成異常,線粒體氧化磷酸化功能出現(xiàn)障礙，更加促進活性氧自由基的產(chǎn)生，線粒體DNA的損傷進一步加重，最終機體組織呼吸頻率下降，氧化磷酸化反應(yīng)進行性減退。當(dāng)經(jīng)線粒體產(chǎn)生的能量不足，不能維持細胞正常的功能時，細胞、組織開始退化，從而引發(fā)衰老[6]。

研究[1，7-9]表明，二至丸可以明顯提高衰老大鼠SOD、GSH-PX、CAT、POD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，降低MDA、LPO含量。本研究發(fā)現(xiàn)二至丸能在一定程度上降低衰老大鼠腦組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ的含量；在二至丸各劑量組中，高劑量組療效最佳。說明二至丸能夠一定程度上改善線粒體呼吸鏈的生理機能，增強機體清除活性氧自由基能力，通過間接降低線粒體DNA的氧化損傷，起到抗氧化防止衰老的作用。

[1]趙雪瑩,王浩然,旺建偉,等.二至丸對衰老模型大鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶影響的研究[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(6):31-32.

[2]羅玲英,熊藝芬,吳鐵榮.二至丸的制備工藝研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(3):41-42.

[3]王少康,孫桂菊,張建新,等.亞急性衰老動物模型的建立及評價[J].東南大學(xué)學(xué)報,2002,21(3):217-219.

[4]李儀奎,金若敏,王欽茂.中藥藥理實驗方法學(xué)[M].2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2006:992-994.

[5]徐建興.呼吸鏈的電子漏路徑和線粒體的超氧自由基代謝及其生物學(xué)意義[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2001,21(5):389-393.

[6]孫巍.脾陽虛證衰老大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ活性和線粒體DNA缺失的實驗研究[D]沈陽：.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),2006.

[7]趙雪瑩,閆忠紅,李冀.二至丸對D-半乳糖致衰老模型大鼠CAT、GSH-PX影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(2):34-36.

[8]李勝志,趙雪瑩,李冀.二至丸對D-半乳糖致衰老模型大鼠SOD、MDA影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥信息,2008,25(3):37-38.

[9]張喆,高長玉,韓偉麗,等.二至丸對D-半乳糖致衰老模型大鼠血清POD活性、LPO含量影響的實驗研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2013,41(6):79-81.

Erzhi pill on mice' mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content induced by D-galactose

ZHAO Xueying,HAN Weili,XU Dan,GAO Changyu*

(Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo study the effect of Erzhi pill on mice' mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content induced by D-galactose,and discuss the mechanism of antioxidant effect of Erzhi pill.MethodsDeterminate mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content with aging mice models induced by D-galactose.ResultsAll doses of Erzhi pill groups could significantly reduce the mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ content which compared with model group.ConclusionErzhi pill could improve the body's antioxidant capacity,and delay body's aging process.

Erzhi pill;mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ,Ⅳ;aging

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.006

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士創(chuàng)新基金(B201102)；黑龍江省博士后科研啟動金資助項目(LBH-Q12009)；黑龍江省教育廳青年學(xué)術(shù)骨干項目(1253G053)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年教師支持計劃項目。

趙雪瑩(1978-)，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事方劑配伍及療效客觀化研究。

高長玉，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，電子信箱-zhaoxueying78@sina.com

R285.5

A

2095-6258(2016)04-0676-03

2015-06-13)