高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究

楊獻玲，徐多多，高　陽*，李紅月，王海洋

(1．吉林省藥品檢驗所，長春130033;2．長春中醫藥大學，長春 130117)

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高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜研究

楊獻玲1，徐多多2，高陽2*，李紅月2，王海洋2

(1．吉林省藥品檢驗所，長春130033;2．長春中醫藥大學，長春 130117)

目的探討高效液相色譜法建立黃芪多糖特征圖譜。方法利用高效液相色譜法對PMP 柱前衍生化的黃芪多糖進行糖組成分析。結果黃芪多糖特定圖譜由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖4種單糖4個共有峰組成。結論高效液相色譜法建立的黃芪多糖特征圖譜，其操作方法簡便，具有良好的重復性及穩定性，可有效控制黃芪多糖的內在質量。

黃芪多糖;鼠李糖;單糖;圖譜;高效液相色譜法

黃芪多糖是黃芪發揮作用的主要成分，由豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根經提取、濃縮、純化而成的水溶性雜多糖。黃芪多糖可作為免疫促進劑或調節劑，同時具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、調節中樞神經系統、降血糖、保肝等作用[1-6]。在多糖的化學研究中單糖組成分析是一項重要內容，隨著現代科學儀器及研究手段的發展,通過 PMP柱前衍生化高效液相色譜法[7-9]進行組成糖分析，為黃芪多糖特定圖譜的建立提供了簡便、高效的方法，該方法具有分離度高，重現性好等優勢。該特征圖譜的建立對控制黃芪多糖的質量具有十分重要的意義。

1　材料

1．1藥品黃芪多糖由吉林敖東藥業集團延吉股份有限公司提供，甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖均購自Sigma公司，純度均 99%以上。

1．2試劑與儀器1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和三氟乙酸(TFA)均購自國藥集團化學試劑有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。Aglient 1200高效液相色譜儀(美國，包括自動進樣器，二元泵，紫外檢測器);梅特勒-托利多儀器有限公司AB204-N分析天平。

2　方法與結果

2．1色譜分離和檢測條件采用Agilent ZORBAX XDB C18(5μ，250 mm×4．6 mm)色譜柱,磷酸鹽緩沖液(pH 6．8 )-乙腈(85∶15)為流動相A，磷酸鹽緩沖液( pH 6．8)-乙腈( 60∶40)為流動相B，梯度洗脫( 0～10 min，流動相A由100% →92%;10～30 min，流動相A由92% →70%；30～40 min，流 動 相 A 為70%；40～50 min，流動相A由70% →100% )，流速0． 9 mL/min，檢測波長250 nm，進樣量10 μL。在上述條件下，樣品中4組分均能達到良好的基線分離，理論板數按葡萄糖衍生物峰計算應不低于30 000。

2．2參照物溶液的制備取無水葡萄糖對照品5 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加水2 mL使溶解，搖勻，加1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液(PMP)1．2 mL，氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，密封，于70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加0．3 mol/L鹽酸溶液調節pH至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，濾過，濾液作為參照物溶液[10-12]。2．3供試品溶液制備取黃芪多糖約10 mg，精密稱定，置螺帽試管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解，密封，于100 ℃烘箱中水解8 h，吹干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，吹干，重復3次，加水2 mL使溶解，即得黃芪多糖水解液。將水解液加上述1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液1．2 mL，氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，置70 ℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，加0．3 mol/L鹽酸溶液調節pH至中性，混勻，用等體積三氯甲烷萃取3次，取水層，濾過，濾液作為供試品溶液[10-12]。

2．4方法學考察2．4．1精密度試驗取同一批供試品溶液，連續進樣6次，考察各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間 RSD 0．041%～0．063%。表明儀器的精密度良好。

2．4．2穩定性試驗取同一批供試品溶液，分別在 0、2、4、8、16、24 h 進樣，考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0．046%～0．054%。表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2．4．3重復性試驗取同一批樣品6份，精密稱定，按照2．3項下方法制備供試品溶液，分別進樣，考察各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果，各色譜峰相對保留時間的RSD為0．685%～0．827%。表明該方法的重復性良好。

2．5樣品測定按照2．3項下方法制備10批樣品的供試品溶液，按照2．1項下色譜條件進行檢測，得到10批樣品特征圖譜，通過比較不同樣品色譜峰，確定 4個共有峰，相對保留時間見表1。

表1　10批黃芪多糖特定圖譜共有峰的相對保留時間

2．6圖譜分析、數據處理和相似度評價

2．6．1圖譜分析、數據處理試驗中將現有已知對照品甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖按照2． 2項下方法制備對照品溶液，分別進樣，通過保留時間確定供試品溶液1號峰為鼠李糖，2號峰為葡萄糖，3號峰為半乳糖，4號峰為阿拉伯糖。通過比對確定在15～20 min之間的色譜峰為PMP溶劑峰。通過10批樣品圖譜分析，上述4個色譜峰為各批樣品所共有，因此確定為共有特征峰。在共有特征峰中，葡萄糖所占比例最大，因此以其為參照峰。

2．6．2相似度評價采用計算機輔助相似度評價系統比較10批樣品HPLC圖譜全譜相似度，10批供試品相似度達到0．9以上。表明10批供試品具有較好的相似度。

3　小結

特征圖譜的相似性是通過色譜的整體性和模糊性來體現的，在不完全清楚樣品的所有成分時，特征圖譜相似性評價可以反映其內在質量的均一性和穩定性。但是，在整體圖譜相似性良好的情況下，樣品所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異。因此，有必要在特征圖譜評價基礎上盡可能增加有效成分的含量測定，進一步評價藥品質量。

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Establishing specific chromatogram of Milkvetch Root polysaccharides by HPLC

YANG Xianling1,XU Duoduo2,GAO Yang2*,LI Hongyue2,WANG Haiyang2

(1.Jilin Institute For Drug Control,Changchun 130033，China;2.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo establish specific chromatogram of Milkvetch Root polysaccharides.MethodsThe monosaccharide composition of Milkvetch Root polysaccharides was determined by HPLC after preparing pre-column derivatization as PMP derivant.ResultsThere were 4 peaks from the specific chromatogram which were rhamnose,glucose,galactose and arabinose monosaccharide respectively.ConclusionThe HPLC method establishing specific chromatogram is a simple,rapid,sensitive and convenient,which can be applied to the quality control of Milkvetch Root polysaccharides.

Milkvetch root polysaccharides;rhamnose;monosaccharide;chromatogram;HPLC

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.014

中華人民共和國國家科技部“中藥提取物標準研究平臺建設”(2012ZX09304005004)。

楊獻玲(1980-),女,大學本科,主管藥師，主要從事藥品檢驗及質量標準的建立與復核。

高陽,男,副研究員,電子信箱-gaoyang-1979@hotmail.com

R284.3

A

2095-6258(2016)04-0701-03

2016-02-25)