參附方提取物經不同腸黏膜透過特性的研究

劉亞楠，張　琦，李超英，蔡　璐，李　擘

(長春中醫藥大學，長春 130117)

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參附方提取物經不同腸黏膜透過特性的研究

劉亞楠，張琦，李超英*，蔡璐，李擘

(長春中醫藥大學，長春 130117)

目的研究參附方提取液經不同腸黏膜的透過特性，探索其口服吸收機制。方法采用Franz擴散池法和家兔腸黏膜進行參附提取液體外滲透實驗，以方中有效成分人參皂苷和人參附子總多糖含量為指標，評價參附提取液經不同腸黏膜的透過率。結果制備的參附提取液中，有效成分人參皂苷經空腸和回腸的穩態滲透速率分別為6．054 5、5．299 5 mg/(cm2/h)；而另一種有效成分總多糖經空腸和回腸的穩態滲透速率分別為3．653 7、3．230 3 mg/(cm2/h)。結論參附方提取液經腸黏膜的透過性存在區段差異，經空腸的透過性高于回腸，并且人參皂苷在空腸和回腸穩態滲透速率明顯高于人參附子總多糖。

參附湯；提取液；體外；腸黏膜

參附湯由人參和附子2味藥組成[1]，最早見于《正體類要》[2]，用于陽氣暴脫之手足逆冷，汗出脈微等癥。方中人參甘溫大補元氣，附子大辛大熱，溫壯元陽，2藥相配，共奏回陽固脫之功[3]。研究口服藥物在腸內吸收與代謝的過程和特性，對于口服藥物制劑、尤其無法采用體內藥代動力學方法的藥物研究具有重要的研究意義[4-5]。本研究采用紫外分光光度法，以參附湯提取液中人參皂苷和人參附子總多糖為檢測指標，對參附方提取液經體外不同腸黏膜的透過性進行研究。

1　材料

1．1藥材與來源附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根加工品。人參為五加科植物人參PanaxginsengC．A．Mey．的干燥根及根莖。附子和人參購于長春市宏檢中藥材批發公司，經長春中醫藥大學高世賢教授鑒定。

1．2試藥人參皂苷Re對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號:110754-200921)；葡萄糖對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號:G5767-25G)；正丁醇；香草醛；高氯酸；冰醋酸；氨水；苯酚；濃硫酸；戊巴比妥鈉等化學品均為分析純。

1．3儀器TK-12A 型透皮擴散試驗儀，TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，pHB-5便攜式pH計(上海偉業儀器廠)。

1．4樣品參附(SF)提取液:為本研究室自制。

1．5動物健康雄性新西蘭兔(吉林大學動物實驗中心提供)，體質量2．0～3．0 kg，動物合格證號：SCXK(吉)2008-0004。

2　方法與結果

2．1參附方提取液的含量測定方法

2．1．1人參皂苷的含量測定方法

2．1．1．1對照品溶液的制備精密稱取人參皂苷Re 8 mg，加甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，制成濃度為0．32 mg/mL的標準品溶液。

2．1．1．2供試品溶液的配置精密量取參附湯1 mL，加水飽和正丁醇5 mL，超聲3次(30 ℃，40 kHz)，第1次30 min，靜置，取出正丁醇層，下層水層再加入水飽和正丁醇5 mL，超聲2次，每次10 min，合并正丁醇層，加3倍量的氨試液混勻，靜置，取上層液至蒸發皿中，水浴揮干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得人參總皂苷液。精密量取人參總皂苷液0．2 mL，水浴揮干，加5%香草醛冰醋酸溶液0．2 mL，高氯酸0．8 mL，振搖，60 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻，加冰醋酸5 mL混勻，即得人參皂苷供試品溶液。

2．1．1．3測定波長的選擇精密量取2．1．1．1項下對照品溶液適量，以甲醇為空白溶液，采用UV法在350～700 nm波長范圍內掃描，確定供試品溶液的最大吸收波長。結果顯示，對照品溶液在548 nm波長處有最大吸收，故選擇548 nm處為最佳檢測波長。

2．1．1．4標準曲線的繪制分別精密量取2．1．1．1項下的對照品溶液0．7、1．0、1．3、1．5、1．7 mL于具塞試管中，水浴揮干，加入5%香草醛冰醋酸溶液0．2 mL，高氯酸0．8 mL，振搖，在60 ℃水浴中加熱15 min后，冷卻2 min，加入冰醋酸5 mL搖勻，即得。在檢測波長為548 nm處測定吸光度值，得人參皂苷標準曲線為Y=8．807 7X-0．037(r= 0．999 7)，說明當其濃度在0．037 3～0．907 mg/mL范圍內線性良好。

2．1．1．5精密度實驗精密量取對照品溶液，在548 nm波長處連續測定6次。結果表明儀器精密度良好，RSD值為0．32%。

2．1．1．6穩定性實驗取參附提取液1 mL，按照2．1．1．2項下的方法進行樣品處理，分別在0、5、10、20、30、45、60 min進行測定。結果在1 h內樣品RSD為0．08%，表明穩定性較好。

2．1．1．7重現性實驗精密量取提取液6份，按照2．1．1．2項下的方法進行樣品處理，在548 nm處進行測定吸光度值，結果RSD值為0．33%，表明重現性良好，方法可行。

2．1．1．8加樣回收率實驗分別精密量取參附方提取液3份，每份0．2 mL于具塞試管中，依次加入比例為1∶0．8、1∶1、1∶1．2的標準品，水浴揮干，按供試品溶液制備方法進行制備，在548 nm波長處測定其吸光度值，測得平均加樣回收率為100．13%，RSD=0．80%，符合回收率要求，結果表明該含量測定方法準確可靠。

2．1．1．9皂苷的含量測定分別量取參附方提取液3份，按2．1．1．2項下方法制備樣品，以甲醇為空白，在548 nm波長處分別測定吸光度，應用標準曲線計算每份樣品中皂苷的含量，結果測得參附方提取液中皂苷平均含量25．489 0 mg/mL。

2．1．2多糖的含量測定方法參照2.1.1人參皂苷的含量測定方法分步進行，結果測得參附方提取液中總多糖的平均含量為12．865 7 mg/mL。

2．2腸黏膜的制備將實驗前禁食24 h(自由飲水)的家兔，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉后固定于手術臺上，取出空腸和回腸，用生理鹽水沖洗干凈，剝離漿膜側的漿膜肌層，以少量生理鹽水濕潤后，備用[6]。

2．3體外滲透實驗采用Franz透皮擴散儀進行滲透試驗，體外模擬家兔腸黏膜的透過環境。將家兔腸黏膜固定于滲透擴散裝置的擴散室和接收室之間，擴散室的有效面積為0．85 cm2，接收介質為pH 6．8磷酸緩沖液(脫氣)，接收池體積為10 mL。稱取參附方提取液1．0 g(含生藥材0．2 g/mL)置于供給室中，在水浴溫度(37．0±0．5) ℃、電磁恒速攪拌100 r/min條件下進行實驗，37．0 ℃恒溫來維持家兔腸黏膜的活性。通過參考文獻及預實驗選定分別在0．5、1、2、3、4、5、6 h時間，在接收側取樣3 mL，同時立刻補充同溫度、等體積的pH 6．8磷酸緩沖液。按照建立的2．1．1皂苷的含量測定方法和2．1．2多糖的含量測定方法進行不同時間樣品中人參皂苷和總多糖的含量測定[7]。

2．4體外滲透結果

2．4．1參附方提取液中人參皂苷、總多糖的累計釋放量實驗中接收池體積為10 mL，取樣量為3．0 mL，擴散室的有效面積為0．85 cm2，根據測得的接受液中含量，計算單位面積累積滲透量Qn，Qn=(CnVn+∑CiVi)/A[9]。公式中Cn為第n個取樣點藥物的校正濃度，Ci是第i個取樣點測得的藥物濃度，Vn和Vi分別是接收池的體積(10 mL)和取樣體積(3 mL)，A是擴散池的擴散面積(A=0．85 cm2)。

2．4．2參附方提取液中人參皂苷、總多糖的釋放速率常數以累積滲透量Qn對時間t1/2進行線性回歸，所得方程即為Higuchi方程[10]，求出直線斜率dQn/dt，即穩態滲透速率Js，見表1、表2。

表1　人參皂苷滲透參數

表2　總多糖滲透參數

3　小結

目前，對總多糖體內的吸收分布，多糖吸收后以何種方式存在，尚缺乏特定的標準化檢測方法[8]。通過本實驗研究，構造了體外模型，為多糖口服藥物吸收分布研究提供了參考依據。本實驗研究參附提取液經不同家兔腸黏膜的透過特性，為參附方制劑應用、給藥途徑與劑型研究提供了理論依據。

[1]來于,吳紅金,鄭思道,等.參附湯對慢性心力衰竭大鼠血流動力學的影響[J].吉林中醫藥,2013,33(3):276-277.

[2]唐凌,孟春芹,李強,等.參附注射液治療惡性腫瘤化療相關性血小板減少[J].長春中醫藥大學學報,2013,29(5):877-878.

[3]黃孝聞,李效賢,張春椿,等.正交設計法優選參附湯提取工藝[J].中華中醫藥學刊,2012,30(2):352-354.

[4]孫思強.大川芎方中阿魏酸、天麻素小腸吸收機理的研究[D].上海:上海中醫藥大學,2011.

[5]衛銀鳳.口服藥物臨床吸收中的生物藥劑學性質探析[J].中國衛生產業,2013(22):58-59.

[6]張韻慧,王春杰,晉興華,等.吲哚美辛水凝膠貼劑小鼠體外透皮性能研究[J].現代生物醫學進展,2013(34):6619-6622.

[7]梁璐,李明艷.不同濃度的透皮吸收劑對白芥平喘凝膠膏中芥子硫氰酸透皮吸收的影響[J].北方藥學,2015(2):88-89.

[8]賴樂,莫紅纓,賴春麗.體外擴散池法評價銀杏酮酯磷脂復合物體外透過性能研究[J].中國藥業,2013(21):13-15.

Permeability of extracting solution across different intestinal mucosa

LIU Yanan,ZHANG Qi，LI Chaoying*,CAI Lu,LI bo

(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo research the permeability of ginseng and Radix aconite lateralis preparata (SF) before and after it prepare into emulsion.MethodsThe percent of passion of the extracting solution was evaluated by anin vitrodiffusion chamber system (Franz) after the membranes were isolated from the intestinal mucosa in rabbits,and the different percent of passion was determined by the ultraviolet spectrophotometry.ResultsThe ginsenoside steady infiltration rate of the extracting solution with dose the extracting solution in jejunum and ileum are 6.054 5·cm2/h and 5.299 5 mg·cm2/h.The ginseng polysaccharide Steady infiltration rate of the oral micro emulsion with dose the extracting solution in jejunum and ileum are 3.653 7 mg·cm2/h and 3.230 3mg·cm2/h.ConclusionThe intestinal mucosal through the performance of extracting solution exist section gap.And the rate after jejunal percent of passion is better than ileum's.

Shenfu decoction;extracting solution;externa;intestinal mucosa

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.015

吉林省科技計劃項目(YYZX201265)。

劉亞楠(1990-)，女，碩士研究生，主要從事藥物新劑型與新型給藥系統的研究。

李超英，女，博士，教授，電話-(0431)86786969,電子信箱-chaoying_li@126.com

R284.3

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2095-6258(2016)04-0703-03

2015-06-24)