三株益生菌對瘤胃體外發酵的影響

陳澤慧，白潔霞，簡　平，王躍麟，倪學勤，，曾東，*（.四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心，四川 雅安 6504；.四川省動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 6504）

三株益生菌對瘤胃體外發酵的影響

陳澤慧1，白潔霞1，簡平1，王躍麟1，倪學勤1，2，曾東1，2*
（1.四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心，四川 雅安 625014；
2.四川省動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014）

通過體外產氣法研究三株益生菌（植物乳酸桿菌、枯草芽孢菌、啤酒酵母）對瘤胃體外發酵的影響。試驗設乳酸桿菌組、酵母菌組、芽孢桿菌組和對照組，分別在4h、6h、9h、12h、18h、24h、36h、48h測定產氣量，發酵48h后檢測乳酸桿菌、芽孢菌和酵母菌數量。結果表明：植物乳酸桿菌、啤酒酵母能明顯促進瘤胃體外發酵，植物乳酸桿菌發揮作用較快，而啤酒酵母較慢但增殖能力更強。

益生菌；體外；瘤胃發酵；產氣

體外產氣法能模擬瘤胃發酵過程［1］，并預測瘤胃對飼料、飼草的消化率［2］。根據體外發酵后的總產氣量和氨產生量可以估測蛋白質降解率［3］，兩者呈正相關關系。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，主要有乳酸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、放線菌、酵母菌等。益生菌可提高瘤胃發酵效率，目前已成為研究的熱點［4-5］。本試驗選取三株常見益生菌（植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母），旨在研究它們對瘤胃體外發酵產氣量的影響，快速評估其發酵效率。

1　試驗材料

1.1 試驗菌種三株益生菌：植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母，由四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心保存和提供。

1.2 主要試劑

1.2.1 培養基MRS、NA、PDA。

1.2.2 瘤胃緩沖液配方A液：微量元素溶液，13.2g CaC12·2H2O、10.0 g MnC12·4H2O、1.0 g CoC12·6H2O、8.0g FeC12·6H2O定容到100mL；B液：緩沖溶液，4.0g NH4HCO3、35.0g NaHCO3定容到1000mL；C液：常量元素溶液，5.7 g NaH2PO4、6.2 g無水KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O定容到1000mL；D液：0.1%刃天青溶液；E液：336.0mg Na2S·9H2O、2mL 1moL·L-1NaOH。取0.12mL A液、237mL B液、237 mL C液、1.22mL D液混合，通入CO2至飽和，保存在39℃恒溫培養箱中，使用時先加入49.5mL E液，并繼續通入CO2致溶液由藍色變為無色，待用。

1.2.3 瘤胃液試驗當天抽取瘤胃液，4層紗布過濾至預熱處理后的收集瓶中，39℃水浴保溫，靜置半小時。

1.2.4 發酵底物玉米面精料和苜蓿粉粗料，按照7∶3比例混合。

1.3 主要儀器空氣浴恒溫振蕩器；自動高壓滅菌鍋；電子天平；智能型電熱恒溫培養箱；恒溫水浴鍋；光學顯微鏡；微量移液器；100mL注射器。

2　方法

2.1 菌株活化與菌液制備將植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母37℃水浴預熱5min，分別在MRS、PDA、NA平板上劃線，并于37℃厭氧或有氧培養24h。參照《微生物檢測技術》手冊，挑取單菌落革蘭氏染色，鏡檢，再次劃線，進行菌種純化培養；然后接種于MRS、PDA、NA肉湯，37℃厭氧或有氧培養24h，采用平板計數法測定細菌數量，并調整數量級為106，4℃保存備用。

2.2 體外發酵以及產氣量測定采用Menke［6］的方法制備瘤胃緩沖液，按照1.0g發酵底物、10mL瘤胃緩沖液與20mL瘤胃液的比例混合均勻，加入100mL注射器中，并分別加入2.1步驟中制備的植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌液和生理鹽水各500μL，即為乳酸桿菌組、芽孢桿菌組、酵母菌組和對照組，每個組設6個重復。此過程中始終向注射器充入CO2，以火焰法檢查，保持厭氧環境，并維持環境溫度在37℃。于50r/min 37℃恒溫下振蕩，并在發酵4 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h后分別記錄產氣量。

2.3 活菌計數采用平板稀釋法計數，將發酵48h后的樣品經10倍梯度稀釋，各梯度分別取10μL稀釋菌液滴種在MRS、PDA、NA平板上，于37℃下厭氧或有氧培養24h。鏡檢，確定目標菌落，計算相應細菌的含菌量。

2.4 數據處理用SPSS19.0軟件對數據進行方差分析，多重比較不同益生菌在各時間點的產氣量差異，用Graphpad prism6分析各時間點的產氣變化趨勢。

3　結果與分析

3.1 不同益生菌對瘤胃體外發酵產氣量的影響三株益生菌發酵48h，產氣變化趨勢如圖1所示。總體上看，產氣量在前6h增加緩慢，隨后產氣變化明顯；6～24h期間，產氣量迅速增加；24～48h期間，產氣量逐漸趨于平緩，增加緩慢。各組產氣總量的變化情況如圖2所示。相比對照組，乳酸桿菌組產氣總量增加了26.9%，酵母菌組增加了10.2%，芽孢桿菌組減少了0.5%。

對不同時間點的產氣量進行方差分析（表1），結果表明：乳酸桿菌組相對其他3組在各時間點上的產氣量增加極顯著（P＜0.01）；與對照組相比，酵母菌組在18～24h期間產氣變化不顯著（P＞0.05），其他時間點上產氣均增加顯著（P＜0.05）；與對照組相比，芽孢桿菌組在9～12h期間產氣增加顯著（P＜0.05），其他時間點上產氣變化不顯著（P＞0.05）。試驗組中，酵母菌組和芽孢桿菌組在發酵初期組間差異不顯著（P＞0.05），在18h后酵母菌組的產氣量極顯著高于芽孢桿菌組（P＜0.01）。

圖1 不同益生菌組的產氣變化趨勢

圖2 不同益生菌組的產氣總量變化情況

表1　不同時間點各組瘤胃發酵產氣量的差異分析

3.2 不同益生菌在瘤胃體外發酵中的數量差異利用平板計數法檢測加入發酵體系的益生菌數量變化情況（表2），結果顯示：乳酸桿菌與芽孢桿菌組相比對照組而言，數量變化不明顯，而酵母菌組與對照組相比，數量顯著增加了10倍以上，說明啤酒酵母在發酵液體系中存活較好，而植物乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌的生長情況明顯比啤酒酵母差。

表2　益生菌數量對比分析

4　分析

本研究以植物乳酸桿菌、枯草芽孢菌、啤酒酵母三株益生菌為研究對象，比較其對瘤胃體外發酵的影響。48h后添加植物乳酸桿菌的產氣量最高，啤酒酵母次之，枯草芽孢菌最低，表明植物乳酸桿菌可促進體外發酵，效果優于啤酒酵母、枯草芽孢菌。Dutta等［7］比較分析了幾株酵母與乳酸菌的發酵效率，發現酵母的發酵效率強于乳酸，這與本試驗的結論相悖，分析原因可能是菌株不同，其作用效果存在差異所致。此外，有研究表明從瘤胃內部分離的假丁酸弧菌對體外發酵有促進作用［8］，并且這種內源性益生菌的安全性較為可靠。對比分析3組發酵速率，發現添加植物乳酸菌可促使發酵迅速趨于平臺期，而啤酒酵母與枯草芽孢桿菌的發酵速率較為緩慢（在乳酸桿菌組達到平臺期后還處于上升期）。除了檢測產氣量以評估三株益生菌的發酵效率外，本試驗還采用相應的培養基檢測了益生菌數量，對比分析結果，發現啤酒酵母相對其他兩組菌，能較好地在瘤胃液中存活，表明其在瘤胃液中的增殖能力強于其他兩株菌。

5　結論

植物乳酸桿菌、啤酒酵母能促進瘤胃體外發酵，植物乳酸桿菌發揮作用較快，而啤酒酵母發揮作用較慢但其增殖能力更強；添加植物乳酸桿菌、啤酒酵母均可提高瘤胃體外發酵效率。■

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［2］Orskov E R.Comparison of in vitro gas production and ny1on bag degradabi1ity of roughages in predicting feed intake in catt1e［J］.Anima1 Feed Science and Techno1ogy，1993，40（2）：109-119.

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［4］Reina A，Tanaka A，Uehara A，et a1.Effects of protease-resistant antimicrobia1 substances produced by lactic acid bacteria on rumen methanogenesis［J］. Asian Austra1asian Journa1 of Anima1 Sciences，2010，23（6）：700-707.

［5］As1im B，Yuksekdag Z N，Sarikaya E，et a1.Determination of the bacteriocin-1ike substances produced by some lacticacid bacteria iso1ated from Turkish dairy products［J］.LWT-Food Science and Techno1ogy，2005，38（6）：691-694.

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［7］Dutta T K，Kundu S S.In vitro rumen fermentation and gas production as affected by probiotics addition［J］. IndianJourna1ofAnima1Sciences，2005，75（7）：817-822.

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The Effect of Three Probiotics on Rumen Gas Production in Vitro

CHEN Zehui1，NI Xueqin1，2，ZENG Dong1，2*，et a1. （1.Research Center of Anima1 Micro-eco1ogica1，Co11ege of Veterinary Medicine，Sichuan Agricu1ture University，
Sichuan Ya'an 625014；
2.Key Laboratory of Anima1 Disease and Human Hea1th of Sichuan Province，Sichuan Ya'an 625014，China）

This paper studied the effect of three probiotics（lactobacillus，bacillus subtilis，beer yeast）on the rumen fermentation in vitro by gas production.Four groups were set up：Lactobacillus group，yeast group，bacillus group and contro1 group，the gas production was measured at 4h，6h，9h，12h，18h，24h，36 h，48 h.After 48 h，the numbers of lactobacillus，bacillus subtilis，beer yeast were detected.The resu1t showed that lactobacillus and beer yeast cou1d promote rumen fermentation in vitro，lactobacillus's function was quicker，and beer yeast was s1ower but its pro1iferation abi1ity was stronger.

Probiotics；In vitro；Rumen fermentation；Gas production

S816.3 文獻標識碼：B

1001-8964（2016）08-0021-03

2016-05-16

四川農業大學大學生創新實驗計劃項目（121062610）。

陳澤慧（1992-），女，內蒙古呼和浩特人，現從事動物微生態研究。

曾東（1961-），男，四川丹棱人，教授，博士生導師，現從事動物微生態研究。