響應面法對栗蘑多糖液體發酵培養基的優化

趙建英 賀瑩

摘 要：該文采用統計學方法對栗蘑虹灰1號菌株進行液體發酵配方優化，以得到適合栗蘑多糖發酵的最佳培養基配比。以栗蘑多糖含量為指標，首先采用前期單因素實驗得出的6個因素，再進行Plackett-Bumrman設計篩選出影響栗蘑多糖含量的關鍵因素，通過響應面法確定關鍵因素的最佳用量和配比。結果表明：栗蘑菌株虹灰1號液體發酵培養基的最佳配方為：黃豆粉15g/L、玉米粉17.25g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀2.237g/L、硫酸鎂2g/L、蛋白胨5.88g/L，并在pH自然、25℃、140r/min條件下培養，比優化前產量提高了76.03%。

關鍵詞：栗蘑；胞外多糖；發酵優化；響應面分析

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）14-0030-05

Abstract：The objective of the present study was the optimization of liquid fermentation medium for producing polysaccharide by Chestnut mushroom by the single factor tests and response surface methodology. Overall research was preceded by rational design. Technological condition parameters were determined according to regression analysis by Design-Expert 7.1.6. The RSM is feasible for optimum extraction process and this will improve the liquid fermentation medium for producing polysaccharide . The optimum condition was as follows：soybean powder 15g/L，corn flour 17.25g/L，glucose 20g/L ，KH2PO4 2.237g/L，MgSO4 2g/L and peptone 5.88g/L，pH7.0，25℃，140r/min，production increased by 76.03% than before optimization.

Key words：Chestnut mushroom；Extracellular polysaccharide；Fermentation optimization；Response surface analysis

栗蘑，又名灰樹花、舞茸，是一種集食用和藥用于一體的菇類，味道和口感俱佳，并且具有良好的藥效，其中栗蘑多糖具有很好的抗癌作用[1]。栗蘑多糖是由葡聚糖及少量蛋白質的異聚糖復合物組成的，主要是以通過β-（1-6）糖苷鍵結合為主鏈的葡聚糖和以通過β-（1-3）糖苷鍵結合為主鏈的葡聚糖的混合活性葡聚糖。傳統提取栗蘑多糖的方法是從野生栗蘑中獲得，然而野生栗蘑數量有限，并且只有在達到一定樹齡的老樹根部才會生長，難以規模化生產[2-3]。而人工栽培栗蘑子實體同樣存在生產周期長、產量有限的問題。通過現代的液體發酵培養技術可以在短時間內獲到大量的栗蘑菌種的發酵產物，研究表明，液體發酵培養得到的栗蘑菌絲體與野生或人工栽培得到的栗蘑在化學成分或生理功能上均很相似，并且發酵液中含有較多的栗蘑多糖。近年來，栗蘑多糖液體發酵的研究取得了長足進展，但由于栗蘑菌株及培養基配方等原因，使培養產物有諸多差異。為此，本研究分別采用單因素試驗、PB設計、中心組合試驗以及響應面法，系統全面地對栗蘑多糖液體發酵培養的培養基配方進行了優化，以期篩選出最佳的培養基配方，從而對栗蘑多糖的發酵生產提供指導[4]。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑 菌種：栗蘑試管菌種（購自唐山食用菌社）。試劑：土豆，黃豆，玉米粉（均購自同達森客超市）；葡萄糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硝酸銨，氯化銨，硫酸銨（均為分析純），蛋白胨，酵母粉，實驗室已具有。

1.2 儀器與設備 KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司），生化培養箱（上海躍進醫療器有限公司；型號 SPX-250），手提式蒸汽滅菌器（江陰濱江設備有限公司），電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司），100g手提式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），超凈工作臺（上海智誠；型號ZHJH-C1112B），恒溫震蕩培養器（上海智誠；型號ZWY-100D），電熱鼓風干燥箱（上海博訊；型號GZX-9146MBE）。

1.3 方法

1.3.1 試驗流程及操作要點 菌種的活化→種子液的制備→單因素試驗→響應面法優化培養條件→驗證試驗。具體步驟為：先將菌種在PDA培養基上活化，并用搖床培養法制備種子液，條件為25℃、140r/min。種子液制備好后進行單因素試驗，即選擇不同碳源、氮源、無機鹽對其進行搖床發酵培養，條件同上，測定栗蘑多糖含量，初步得出各因素對其的影響。再用響應面法對其營養條件進一步優化，通過驗證性試驗證明響應面方法優化得出栗蘑多糖的最佳發酵工藝條件是否具有良好的效果。

1.3.2 菌種的活化 將買回的菌種用已消毒的器具挖取1cm2大小，然后接種到PDA培養基上，25℃通風培養20d左右，待長出菌絲體后，存于4℃冰箱備用[7]。

1.3.3 接種及培養方法 選取250mL錐形瓶緩慢倒入100mL已經配好的種子培養液，從制好的菌株中挖取少許菌絲體，加入錐形瓶中，25℃、140r/min條件下培養5d，制成種子液。選取500mL錐形瓶加入150mL發酵培養液，接入15mL種子液，25℃、140r/min條件下培養6d[7]。

1.3.4 多糖的提取及測定 參加文獻[8-9]。

1.3.5 單因素試驗 對碳源的5個水平（葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、玉米粉），氮源的5個水平（牛肉膏、蛋白胨、黃豆粉、氯化銨、硝酸銨），無機鹽的5個水平（磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、氯化鈣）分別進行發酵培養并測定栗蘑多糖含量，各因素均設有對照組，每一水平均設有3個平行實驗。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗設計 根據前期單因素試驗，選用N=12的Plackett-Burman（PB）試驗設計，對黃豆粉（A）、玉米粉（B）、葡萄糖（C）、磷酸二氫鉀（D）、硫酸鎂（E）和蛋白胨（F）這6個因素進行編排組合并通過試驗進行篩選，同時增加5個虛擬變量。每個因素取“一高一低”2個水平，以栗蘑多糖的含量（g/L）為響應值，如表1所示。

1.3.7 最陡爬坡試驗 用最陡爬坡法可以快速有效地進入最優點所在的臨近區域。而且可以根據Plackett-Burman（PB）試驗結果中篩選出的顯著因子的效應大小來確定最陡爬坡試驗的方向和梯度，其他因素均取最大值，測定栗蘑多糖含量的變化趨勢，確定后續試驗因素的中心。

1.3.8 Box-Behnken Design響應面優化 根據上述Plackett-Burman（PB）試驗設計和最陡爬坡試驗中確定的試驗因素及最佳點，采用Box-Behnken Design法進行3因素3水平的響應面優化，以此得到最佳的配方，如表2。

1.3.9 驗證試驗 將優化后的液體發酵培養基配方配置成培養液，以10%的接種量接入栗蘑菌種25℃，140r/min條件下培養6d，測定栗蘑多糖的含量，并重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果 單因素碳源、氮源、無機鹽對栗蘑多糖的含量均有影響，如圖1所示。由圖1可知，玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨3種因素對栗蘑多糖含量的影響較為明顯，為進一步確定發酵培養條件的最佳用量，需通過響應面進一步優化。

2.2 Plackett-Buman試驗篩選顯著因子 Plackett-Buman實驗設計和結果見表3，因素效應分析和重要性評估見表4。從表4可以看到，A（黃豆粉）、B（玉米粉）、C（葡萄糖）、D（磷酸二氫鉀）、E（硫酸鎂）、F（蛋白胨）這6個因素的系數均為正數，即A、B、C、D、E、F這6個因素對栗蘑多糖含量影響都是正效應，也就是說隨著這些因素水平的增加，栗蘑多糖含量逐漸增加。6個因素對實驗結果的F值（貢獻率）的大小排序依次為：D（磷酸二氫鉀）>F（蛋白胨）>B（玉米粉）>E（硫酸鎂）>C（葡萄糖）>A（黃豆粉）。其中磷酸二氫鉀的P值小于0.01，影響極為顯著；蛋白胨和玉米粉的P值小于0.05，影響顯著。所以選用這3個因素作為主要的研究對象作后續研究。

2.3 最陡爬坡試驗確定最大相應區域 對Plackett-Buman實驗篩選出的顯著因子玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨進行最陡爬坡試驗，3個因子對栗蘑多糖含量的影響均為正效應，所以各個因素梯度為上升方向。試驗設計見表5。

通過表5可以得到，隨著玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨濃度的增加，栗蘑多糖含量呈現先上升后下降的趨勢。栗蘑多糖含量出現最大值是在試驗3中，所以該處是最大的影響區域。因此選用此條件作為后續響應面的中心點。

2.4 多元二次回歸的模型建立及分析方差 以玉米粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨3個因子作為為變量并分別標號為X、Y、Z，以栗蘑多糖含量作為為響應值，設計3因素3水平的Box-Behnken Design試驗。以上數據均通過Design-Expert 7.1.6軟件輔助完成并進行分析，設計和結果見表6。

利用Design-Expert 7.1.6軟件對上表中數據進行編程，得到回歸方程：

由表7進行回歸模型的方差分析。

通過方差分析可以看出，該模型的Prob>F值是<0.000 1的，也就是說結果的額差異性只有0.01%的概率是由于誤差引起的，表明此模型差異極其顯著，可以接受；失擬項Prob>F值是0.760 6，大于0.05表明失擬項不顯著，說明模型在整個回歸區域內有很好的擬合度，與真實的響應面情況接近，說明模型建立合理。CV表示模型的精確度，CV值越低，說明模型可信度越高，本次試驗模型的CV=0.17%比較低，可信度高，表明試驗可以信服。模型的決定系數R2=99.53%，說明預測值和實際值間具有高度相關性，能解釋的響應值變化，所以可以用此模型對栗蘑多糖的含量進行測量。

2.5 響應面交互作用分析及尋求最優點 根據表6繪制S隨X、Y、Z變化關系的響應面立體圖，如圖2所示。由圖2可知，S值（栗蘑多糖含量）在試驗區有最大值。通過建立的回歸的模型可以估測，S的最大值為2.49g/L，此時X（-0.55）、Y（0.47）、Z（-0.06）即玉米粉17.25g/L、磷酸二氫鉀2.237g/L，蛋白胨5.88g/L。

從響應面的最高點和等值線可以直觀的看出，在所選范圍內存在極值，也就是響應面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。當蛋白胨位于中心點時，磷酸二氫鉀添加量對響應值峰值的影響較玉米粉添加量影響大，當磷酸二氫鉀處于中心點時，玉米粉的添加量對響應值峰值的影響較蛋白胨添加量影響大；當玉米粉處于中心點時，磷酸二氫鉀的添加量對響應值峰值的影響較蛋白胨添加量影響大。響應面圖分析與方差分析相符，表明通過本試驗建立的栗蘑多糖液體發酵培養基模型是合適的模型。

2.6 擬合優化的驗證 為驗證響應面法所得結果是否可靠，在上述條件下經3次重復試驗驗證，預測值與驗證值接近，實際測得的栗蘑多糖含量為2.48g/L，與估測值相比，其相對誤差很小。因此，通過響應面法所得的栗蘑多糖發酵培養基參數準確可靠，所建立的模型可信度良好。

3 結論

通過試驗證明，響應面分析方法對該栗蘑菌株液體發酵條件的優化具有良好的效果。本次研究經響應面方法優化得出栗蘑多糖的最佳發酵工藝條件為：黃豆粉15g/L、玉米粉17.25g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀2.237g/L、硫酸鎂2g/L、蛋白胨5.88g/L，并在pH自然、25℃、140r/min條件下培養，發酵栗蘑多糖含量為2.48g/L，比優化前產量提高了76.03%。

參考文獻

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（責編：張宏民）