氧化苦參堿對人黑素細胞增殖與炎癥因子自分泌的影響

羅　宏范英姬　王海波　王　娟　張　艷　杜　倩

氧化苦參堿對人黑素細胞增殖與炎癥因子自分泌的影響

羅宏☆范英姬王海波王娟張艷杜倩

目的： 明確氧化苦參堿（OMT）對黑素細胞增殖、TLR3、NF-κB的mRNA表達及相關細胞因子的影響。方法： 人表皮黑素細胞傳代培養，分為空白對照組及不同濃度的氧化苦參堿組（10μmol/ L，50μmol/L和100μmol/L），用MTT法測定細胞增殖，RT-qPCR檢測TLR3、NF-κB的mRNA表達，ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-8及IL-17表達。結果： 各組黑素細胞的吸光度值均顯著高于空白對照組，隨OMT濃度上升而升高，當OMT濃度為50μmol/L時增殖率達到平臺期。OMT組TLR3及NF-κBmRNA及IL-6、IL-8及IL-17蛋白表達較對照組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：

氧化苦參堿可促進黑素細胞的增殖，下調TLR3、NF-κB的mRNA表達，減少IL-6、IL-8及IL-17的生成。

氧化苦參堿? 黑素細胞? TLR3? NF-κB

白癜風是皮膚科常見的色素障礙性疾病，本病參與機制復雜，臨床上表現為發生于局部皮膚黏膜的色素減退或脫失性疾病。世界人群發病率為0.5%～1%，目前有逐年上升趨勢［1］。免疫損傷是白癜風發病的關鍵步驟之一，而氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）具有較好的抗炎和免疫調節藥理學效應，在呼吸、消化、血液等不同醫學領域里發現OMT對NF-κB增殖抑制通路具有抑制作用，且其能減少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達［2-4］。而且在過敏性皮膚病、色素異常性皮膚病等皮膚科多種疾病的臨床應用中，苦參素皆可表現出穩定且安全的治療效果。因此，在針對白癜風患者的治療里，本研究欲尋求OMT是否可通過阻斷TLR3-NF-κB增殖抑制通路，減輕炎癥所致黑素細胞的凋亡，從而達到治療效果呢?為此，我們進行了一系列細胞實驗，用MTT、ELISA、RT-qPCR等方法檢測了OMT處理黑素細胞后細胞的增殖情況，以及OMT對相關炎癥因子的表達影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細胞 收集我院外科門診健康成人包皮環切術后手術標本，患者既往無白癜風，且無白癜風家族史，標本經患者知情后簽署同意書，將黑素細胞分離及體外培養，使用第3代細胞進行實驗。

1.1.2實驗儀器與試劑配制 98%高純度氧化苦參堿（中國藥品生物制品檢定所）：氧化苦參堿水溶性好，加入不同體積的蒸餾水分別溶解成10μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L濃度備用?核因子受體激活劑RANK（美國Sigma公司）：滅菌蒸餾水溶解配制成濃度為50 ng/mL［5］?Medium 254細胞培養基、生長因子HMGS、胎牛血清、PBS液（美國Gibco公司）?胰蛋白酶（上海碧云天）?二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素（美國Sigma公司）?MTT粉（VETEC）?超凈工作臺（蘇州安泰）?二氧化碳培養箱（德國Heraeus）?倒置顯微鏡（日本Olympus）?酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海西塘生物）?LightCycler480熒光定量PCR系統等。

1.2實驗方法

1.2.1人表皮黑素細胞傳代培養 將包皮組織去除皮下組織部分并分離成小塊狀，加入分離酶將表皮部分分離后，再添加胰蛋白酶消化制成細胞懸液，重復數次，用細胞計數板計數，按5×105個/mL密度接種于培養瓶，放入37℃、5%二氧化碳培養箱中過夜，每日觀察細胞生長狀態并及時換液。當細胞在瓶內鋪壁約80%時，加入胰蛋白酶差別消化，提純黑素細胞。傳至第3代并通過測序驗證的黑素細胞用于后續實驗。

1.2.2實驗分組 第3代黑素細胞貼壁80%左右時，胰蛋白酶消化后以1×105個/mL密度接種于96孔板過夜，次日棄去廢液，空白對照組只加入新鮮培養基? OMT組分別加入含10μmol/L、50μmol/L、100μmol/ L這3種濃度的培養基各100μL，RANK組在OMT處理組基礎上加入含50 ng/m L RANK的培養基100 μL，空白對照組則加入完全培養基100μL，每組設6復孔，將其放置二氧化碳培養箱內繼續培養48 h。

1.2.3黑素細胞增殖率檢測 結束培養后按照MTT步驟，各孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，放回培養箱孵育4 h，后去除上清，各孔加入DMSO 150μL，上搖床震蕩10 min使結晶充分溶解。最后用酶標儀測各孔490 nm處光吸收度，重復三次并記錄數據。細胞增殖率=（OMT組A490值-空白對照組A490值）/對照組A490值×100%。

1.2.4OMT促進黑素細胞增殖分子信號通路的檢測選擇能促進黑素細胞增殖最佳的OMT濃度（50 μmol/L），培育24 h后提取細胞總RNA。應用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板進行RT-qPCR熒光定量檢測TLR3、NF-κB、IL-6、IL-8及IL-17 mRNA表達情況。引物序列見表1。引物由上海生工生物公司合成。

表1　目的基因及內參基因引物序列

1.2.5OMT對黑素細胞表面IL-6、IL-8及IL-17表達水平的檢測 50μmol/L OMT培育各組細胞24 h后，按照酶聯免疫試劑盒說明，取各組上清液檢測IL -6、IL-8及IL-17的表達。

1.2.6NF-κB激動劑RANK對OMT處理下黑素細胞的影響 細胞培養方式同上，當黑素細胞接種至96孔板過夜后，次日棄去廢液，加入含有50μmol/L OMT培養基培養24 h后，再加入NF-κB激動劑RANK（終濃度為50 ng/mL）繼續培養24 h然后用RT -qPCR法檢測TLR3、NF-κB的表達，用ELISA技術檢測IL-6、IL-8及IL-17的表達情況。

1.2.7統計學方法 SPSS 18.0軟件進行統計分析，數據用ˉx±s表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為有統計學意義。

1.3結果

1.3.1MTT檢測OMT對黑素細胞增殖的影響 通過MTT法測得各組細胞吸光度并計算細胞增殖率，行方差分析及LSD-t檢驗，加入OMT培養48 h后，各組黑素細胞的吸光度皆顯著高于空白對照組，不同濃度OMT組間比較，細胞增殖趨勢隨OMT濃度上升而升高，當OMT濃度為50μmol/L時增殖率達到一個平臺期（?P<0.05???P>0.05）見圖1。因此，后續實驗選擇培養時間48 h，50μmol/L OMT為實驗濃度。

1.3.2RT-qPCR檢測黑素細胞TLR3及NF-κB的mRNA表達 收集對照組、OMT處理組、OMT+RANK處理組細胞。TRIZOL法提取總RNA，逆轉錄后用RT -qPCR方法檢測TLR3、NF-κBmRNA表達情況。所得結果如圖2所示。我們可見，加入50μmol/L濃度的OMT后，黑素細胞TLR3、NF-κB mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義。加入NF-κB特異性激動劑RANK后，TLR3與NF-κB mRNA表達得到恢復。說明OMT可以介導TLR3-NF-κB通路，降低TLR3、NF-κB的mRNA表達。

?P<0.05???P>0.05圖1　MTT檢測OMT對黑素細胞增殖的影響

圖2　RT-qPCR檢測OMT、RANK處理后，黑素細胞TLR3、NF -κB mRNA表達情況

1.3.3ELISA檢測黑素細胞IL-6、IL-8及IL-17的表達 黑素細胞經不同處理后，應用相應的ELISA試劑盒測得上清液內IL-6、IL-8及IL-17的結果如表2所示。經方差分析可見，空白對照組相比，加入OMT的黑素細胞所表達出的炎癥相關細胞因子IL-6、IL-8和IL-17均減少，差異有統計學意義。加入NF-κB特異性激動劑RANK后，IL-6、IL-8與IL-17的產生較OMT組明顯升高。

表2　不同處理組對IL-6、IL-8及IL-17表達情況

2　討論

白癜風是一種以黑素細胞丟失和白斑形成為特征的色素障礙性皮膚病，它的發病是多基因遺傳、在多種環境刺激因子的激發下表現出免疫功能紊亂，表皮黑素細胞（melanocyte，MC）受到破壞，導致局限或泛發性色素脫失，最終在局部皮膚形成大小不等、數目不定的色素完全脫失斑［4，6］。它在我國人群患病率呈逐年上升的趨勢，由于病程不定，病因不清，治療困難，往往給患者帶來心理負擔。近年來，臨床上對于白癜風，除光療以外的大部分內科療法采用免疫調節劑，細胞毒性藥物以及外科自體黑素細胞移植［7］。但由于白癜風病因并不完全明確，部分患者同時合并其它自身免疫疾病，傳統療法具有一定療效，但存在局限性。因此尋找靶向藥物尤為重要。白癜風存在一定的免疫學基礎、大量研究表明細胞免疫、體液免疫及相關細胞因子參與病情活動，其中以細胞免疫的效應較為突出，自身免疫介導的黑素細胞凋亡一直是關注的熱點［8］。實驗研究發現患者外周血及皮損區IL -1β、IL-6、IL-8、IL-17、及TNF-α等炎癥因子的表達均顯著上調［9，10］。這些炎癥因子的表達增高，在趨化中性粒細胞至皮損區，促進白細胞與黑素細胞相互黏附，以及激活細胞毒T細胞等過程中發揮重要作用，從而加速免疫損傷推動疾病發展的進程。

已知由TLR3介導的T細胞依賴的B淋巴細胞激活，導致大量致病相關性抗體及細胞因子的產生，從而促使黑素細胞凋亡，是白癜風發病的主要原因之一。新近研究發現黑素細胞上可以表達功能性的TLRs，且TLR3通過激活NF-κB信號通路介導黑素細胞的凋亡［11］。TLRs主要表達在免疫細胞和多種炎癥細胞表面，如樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）、巨噬細胞和T、B細胞等，與其相應的配體結合后可以激活中性粒細胞等免疫細胞，使其分泌大量的炎性細胞因子和趨化因子，參與活化天然免疫應答和特異性免疫應答［12］。體內外實驗研究發現抑制TLR3活性后黑素細胞的凋亡也逐漸減輕。通過轉染針對TLR3的ShRNA慢病毒載體，抑制原代培養的黑素細胞中TLR3的表達。然后用流式細胞術檢測下調TLR3表達黑素細胞凋亡情況發現，穩定轉染shTLR3的黑素細胞受到poly（I：C）刺激后，其凋亡率明顯降低，提示TLR3介導了dsRNA對黑素細胞的促凋亡效應。且TLR3活化后能誘導I型IFN（包括IFN-α和IFN-β）的釋放，而I型IFN可以誘導黑素細胞凋亡途徑的激活。臨床治療發現在一些接受I型干擾素治療的患者中可以發生白癜風，說明TLR3信號通路在白癜風的誘發以及病情活動中可能發揮一定作用［13］。因此，靶向調控TLR3受體的功能將有助于調控黑素細胞介導的T、B細胞活化及T細胞介導的多種免疫應答功能，對特異性治療白癜風具有重要的理論和臨床意義。氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）具有較好的抗炎和免疫調節藥理學效應，且在我們多年臨床用藥中發現OMT對白癜風具有良好的治療作用［14］。在早期實驗中，馮亞珍等［15］通過喂養小鼠實驗發現OMT在小鼠體內具有抑制T細胞、B細胞和腹腔巨噬細胞的免疫功能活性作用。并且最新研究發現OMT對NF-κB凋亡信號通路具有抑制作用，且其能減少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達［2，14］。

本實驗給黑素細胞加入一定濃度差的OMT后，黑素細胞的增殖較對照組顯著提高。RT-qPCR檢測TLR3及NF-κB mRNA則顯示出OMT對其表達產生抑制作用，與熊永愛等研究結果一致。當加入NF-κB特異性激活劑RANK后，由PCR結果可見NF-κB以及TLR3的測值與空白組表達程度相似，說明OMT參與TLR3-NF-κB凋亡通路變化，并能拮抗RANK作用，靶向抑制細胞凋亡通路的激活，從而保護黑素細胞。隨后我們進一步檢測黑素細胞上清液的情況，IL -6、IL-8、IL-17在OMT加入后表達減少，當有RANK存在時，IL-6、IL-8、IL-17檢測值接近空白組，說明IL-6、IL-8、IL-17參與TLR3-NF-κB凋亡通路，受通路正反饋調節，在細胞凋亡中發揮作用。加入50 μmol/L OMT后的黑素細胞數目比對照組顯著增高，且TLR3-NF-κB及相關炎性細胞因子表達下降，可見OMT可能是通過抑制TLR3介導的T、B細胞活化，而抑制IL-6、IL-8、IL-17等炎癥因子的產生，通過阻斷TLR3-NF-κB凋亡通路，抑制黑素細胞的凋亡，從而保護黑素細胞。

本研究采用第3代黑素細胞，觀察到OMT可抑制凋亡通路TLR3-NF-κB及減少相關細胞因子的產生，可見OMT能靶向調控黑素細胞上TLR3受體表達及其信號通路，將有助于從根源上治療自身免疫性白癜風，這將是OMT在白癜風治療領域的一大進展，但OMT臨床上在何種條件及何種濃度時對白癜風患者達到滿意療效，還需進一步的動物及臨床研究證實。

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（收稿：2015-12-05 修回：2016-01-05）

Influence of oxymatrine on themelanocyte proliferation and inflammation factor autocrine

LUO Hong，FAN Yingji，WANG Haibo，WANG Juan，ZHANG Yan，DU Qian. Chenzhou 3rd People's Hospital，Hunan 423000，China

LUO Hong，E-mail：3602677@qq.com

Objective：To determine the influence of oxymatrine（OMT）on the melanocyte proliferation and inflammation factor autocrine.M ethods：The cultured melanocytes were divided into blank group and oxymatrine groups with different concentrations（10μmol/L，50μmol/L and 100μmol/L）.The proliferation ofmelanocyte，mRNA of TLR3 and NF-κB and the expression of IL-6，IL-8 and IL-17 were detected by MTT method，RT-qPCR and ELISA respectively.Results：Absorbance values of the melanocytes in oxymatrinegroupswere higher than that in control group，in a concentration-dependentmanner.The proliferation rate reached a plateau when OMT concentration reached up to 50μmol/L.The expression of TLR3 and NF-κBmRNA and the proteins of IL-6，IL-8，IL-17 in OMT groups were significantly lower than those in control group（P<0.05）.Conclusion：OMT can increase the proliferation ofmelanocyte，down-regulate the expression of TLR3 and NF-κB mRNA and the protein of IL-6，IL-8 and IL-17.

oxymatrine?melanocyte?TLR3?NF-κB

湖南省衛生廳科研計劃項目（編號：C2014-59）郴州市科技局計劃項目（編號：CZ201314502）

郴州市第三人民醫院，湖南郴州，423000

☆現工作單位：長沙市第一人民醫院，410005

羅宏，E-mail：3602677@qq.com