308 nm準分子激光照射兔耳最小紅斑量

岳學蘋王宏偉

·病例報告·

308 nm準分子激光照射兔耳最小紅斑量

岳學蘋1，2王宏偉1

目的： 明確308 nm準分子激光照射兔耳最小紅斑量（Minimum Erythema Dose，MED）。方法： 應用308 nm準分子激光照射30只兔子左耳，分別給予單次單劑量150、300、450、600、900、1350 mJ/cm2，右側作對照。計算30只兔耳激光照射24、48、72 h后的MED平均值，并觀察96 h后組織病理和透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）下超微結構的改變。結果： 經308 nm準分子激光照射后，24、48和72 h后MED平均值均為（300±55.39）mJ/cm2，其中86.6%（24只兔）MED值為300 mJ/cm2。照射96 h后MED區較未照射區的組織病理：表皮和真皮層增厚，真皮水腫、毛細血管擴張，血管周圍大量炎癥細胞浸潤，可見紅細胞外滲。TEM：MED區照射96 h后膠原纖維變性、排列紊亂，纖維細胞細胞器凝聚呈團塊狀變性；血管周圍可見炎癥細胞浸潤，紅細胞外滲；部分血管管腔狹窄，血管內皮細胞和周細胞細胞核形態異型。96 h后紅斑逐漸消退，10～14天內消失，病理和TEM均未見大面積壞死。結論： 308 nm準分子激光是一種高效穩定和安全的光源。

308 nm準分子激光； 最小紅斑劑量； 防曬

308 nm準分子激光是一種新型紫外線激光光源，為氯化氙（XeCl）準分子激光，其本質上是激光，具有激光的高方向性、單色性、高亮度和相干性。308 nm準分子激光可以在瞬間發射高強度、高能量、單一波長的308 nm紫外光（Ultraviolet B，UVB），直接照射局部皮損部位，對周圍組織無明顯損傷，因此可以明顯縮短病程和治療次數。臨床上為了提高308 nm準分子激光治療各種疾病的有效性，需要預估或預測最小紅斑劑量（MED），以決定起始照射劑量，因此我們進行最小紅斑量動物實驗的體內測定方法的研究。以往研究大多以人體為研究對象，此次我們選擇兔耳為對象研究308 nm準分子激光照射后MED的測量方法，期待驗證該激光在動物體內實驗中的穩定性、一致性、高效性和安全性，為該光源的其他應用提供基礎研究。

近年來，308 nm準分子激光在皮膚科治療白癜風、銀屑病、異位性皮炎等疾病中取得了顯著療效［1-7］。應用308 nm準分子激光治療各種皮膚疾病，如果起始照射劑量太低，會延長照射時間，太高又可能造成紅斑甚至水皰，因此預估MED，選擇從亞紅斑劑量或1～2倍的MED開始照射，可以達到減少療程、減少副作用、提高療效的目的。關于308 nm準分子激光對人體，尤其是對白癜風或銀屑病患者MED的測定，相關報道很多。Asawanonda等［4］應用308 nm準分子激光治療銀屑病，測得人體 MED為（203.03±57.84）mJ/cm2。Ichihashi等［8］測定的人體曝光部位 MED為 20 mJ/cm2，Waterston等［9］發現UVB照射人體不同部位皮膚后的紅斑反應，結果最大可有5倍差異。那么308 nm準分子激光照射皮膚后，MED的測定方法是否穩定一致？是否具有可重復性？測定方法是否方便快捷高效？以及組織病理和TEM下發生什么改變？對皮膚是否有損傷？該方法是否安全？上述問題的相關研究不多。鑒于人體實驗的倫理性和安全性很難執行，我們選擇兔耳進行實驗，以規避人體實驗的風險，來研究308 nm準分子激光照射后MED的測量方法的穩定性、一致性，并通過病理及TEM來判斷該激光照射后超微結構的改變和該方法的安全性。期待驗證308 nm準分子激光作為穩定高效安全的UVB光源，進行光敏感或防曬霜的防護性能檢測等方面的研究。

1 對象和方法

1.1 測試對象 測試對象為日本大耳白兔（由北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司提供），研究區域為左側兔耳內部無毛區域，共30只，依次編號為1～30號兔子，雌性15只，雄性15只。納入標準：月齡、體重、耳朵大小基本一致，耳朵內部要求毛發稀疏，血管走形規律，顏色接近正常膚色。排除標準：兔耳內部毛發異常增多，血管異常充血或畸形，顏色異常充血或發紅。本實驗獲得了首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科研究所動物倫理理論委員會的批準。1.2 測定儀器 308 nm準分子激光儀（EX-308，Excimer Laser Phototherapy System，RA Medical Systems. INC.CARLSBAS，CA，USA）；能量計測定儀（LabMax TO激光能量計，Coherent，USA）；相機（佳能500D，鏡頭為18～135 mm f/3.5～5.6 IS）。

1.3 測定方法 第一天，在兔子左耳內側中央無毛區域選5 cm×3 cm區域，盡量避開血管。按照左側縱向3個點（從上往下依次為1～3號），右側縱向3個點（從上往下為4～6號），彼此間隔1 cm，共選6個點，每個點給予單次單劑量308 nm準分子激光照射。首先，每次照射前先用激光能量計測定該次照射的能量，多次測量能量數據結果顯示能量穩定持續，1 s的照射劑量為150 mJ/cm2。選取同一耳朵6點照射區域，周圍未照射區為陰性對照；因為兔耳受照面積有限，開始照射時間按50%遞增，即1～6號依次為1、2、3、4、6、9 s；對應的照射劑量依次為150、300、450、600、900、1350 mJ/cm2。照射24、48、72 h后分別測定MED，MED定義為對應時間內最先出現圓形紅斑所對應的最小劑量。結果判讀時，由3名觀察者同時判斷，至少2名觀察者同時認可的劑量為測試結果。最后每只兔子獲得一個24 h、48 h、72 h后的MED值，然后計算30只兔子在24 h、48 h和72 h后MED的平均值。96 h后隨機抽取5只兔子，對左耳未照射區和96 h后MED區取活檢，行組織病理和TEM檢查。活檢時，先用25%烏拉坦按2 mL/kg腹腔注射給予全身麻醉，切除正常未照射部位和MED部位的兔耳全層，每個部位按1∶2分為2份，大份放入4%福爾馬林固定后行組織病理學檢查，小份切成1 mm×1 mm固定在4%多聚甲醛-2.5%戊二醛中，4℃冰箱固定2 h后進行TEM檢查。

1.4 統計學方法 根據30只兔耳在24 h、48 h和72 h各自的MED值，計算出其MED的平均值。

2 結果

2.1 兔子的基本情況 兔子共入選30只，依次編號為1～30號兔子，雌雄各15只，均65天左右，體重分別在2 kg左右。

2.2 MED結果 MED的判讀標準為對應時間內最早出現圓形紅斑時對應的最小劑量。測得30只兔耳24 h、48 h和72 h的MED結果非常一致，平均為（300 ±55.39）mJ/cm2，其中86.6%（26只）為300 mJ/cm2，6.7%（2只）為150 mJ/cm2，6.7%（2只）為450 mJ/ cm2。MED區表現為圓形的充血性紅斑（圖1），第四天開始紅斑逐漸減弱，10～14天徹底消退。

2.3 病理結果

2.3.1 組織病理 未照射區（圖2a）：真表皮完整，無增厚，真皮無炎癥細胞浸潤，無血管擴張。MED處照射308 nm準分子激光后96 h：表皮完整，無角化不全和角化過度，表皮可見日曬傷細胞（即凋亡的角質形成細胞），表皮和真皮水腫、增厚，真皮全層有毛細血管擴張，紅細胞外滲，血管周圍有炎癥細胞浸潤（圖2b）。

2.3.2 TEM 未照射區：表皮完整，真皮層未見毛細血管擴張和炎癥細胞浸潤，局部真皮膠原纖維（圖3a）完整、橫向和縱向均排列整齊；纖維細胞（圖3b）形態正常，細胞核和細胞器清晰可見；毛細血管管腔無擴張，血管周圍無炎癥細胞浸潤和紅細胞外滲。MED區308 nm準分子激光照射后96 h：可見真皮層膠原纖維變性（圖3c）、排列紊亂，斷裂或扭曲；纖維細胞（圖3d）變性，細胞器凝聚呈團塊狀變性；部分血管周圍可見炎細胞浸潤及紅細胞外滲，個別血管管腔狹窄，血管內皮細胞和周細胞細胞核形態異型。

圖1 308 nm準分子激光照射兔耳24 h后的MED，約300 mJ/cm2圖2 2a：未照射區組織病理：表皮真皮完整，無增厚，真皮無血管擴張和炎癥細胞浸潤（HE，×200）；2b：MED區96 h后組織病理：表皮完整，無角化不全和角化過度，表皮可見日曬傷細胞（箭頭所示），表皮和真皮增厚，真皮水腫，真皮全層有毛細血管擴張，紅細胞外滲，血管周圍有炎癥細胞浸潤（HE，×200）

圖3 3a：未照射區TEM：橫線和縱向的真皮膠原纖維排列整齊、結構清晰（TEM，×20000）；3b：正常兔耳TEM：真皮纖維細胞結構完整，細胞器清晰可見（TEM，×30000）；3c：MED區96 h后TEM：真皮膠原纖維變性，排列紊亂，斷裂，扭曲（TEM，×20000）；3d：MED區96 h后兔耳TEM：真皮纖維細胞變性，細胞器和細胞核凝聚呈團塊狀（TEM，×30000）

3 討論

本實驗，我們采用308 nm準分子激光測得兔耳在24 h、48 h和72 h內的MED值均高度一致，平均值為（300±55.39）mJ/cm2。組織病理和TEM顯示：與未照射區對比，照射96 h后MED區，表皮和真皮層增厚，真皮水腫、毛細血管擴張，血管周圍大量炎癥細胞浸潤，可見紅細胞外滲。TEM下可具體看到膠原纖維變性、排列紊亂，纖維細胞細胞器凝聚呈團塊狀變性。96 h后紅斑逐漸消退，10～14天內紅斑消失，病理和TEM均未見大面積壞死。

關于MED值的測定，基于Waterston等［9］發現人體不同部位照射UVB后皮膚的紅斑反應，結果可以最大有5倍的差異。安全性方面，如果進行人體試驗，照射后在人體多個部位取活檢，不容易被人體接受，因此我們選擇兔耳進行動物實驗。選擇兔耳，首先，兔耳內側表皮和真皮的皮膚結構與人體結構大體類似（每層細胞厚度不同）；其次，兔耳沒有毛發，不需剃毛，且顏色接近正常膚色，因此可模擬人體進行MED的測定和觀察。該特殊部位膚色便于觀察紅斑反應和取活檢。因此本實驗選擇兔耳作為實驗對象和部位進行308 nm準分子激光照射測定MED值的測定方法的研究，在國內外暫無類似報道。盡管人的MED值因個體、部位不同而有明顯差異，但針對每一個人同一部位，通過本實驗，我們推測應用308 nm準分子激光照射后結果可能會穩定一致，但有待進行人體實驗進一步驗證。

測定MED時，因為每次照射前測量激光能量都很穩定呈直線分布，能保證給予的照射劑量穩定。我們選擇24 h、48 h和72 h三個時間點觀察MED結果，高度一致穩定，且86.6%的MED均為300 mJ/ cm2，足以證明308 nm準分子激光這一激光光源的穩定性和一致性。因此也證明用于治療白癜風等疾病時，發射劑量的穩定性。

應用此激光光源照射時，激光可以瞬間在局部發出很高的能量，使達到MED的照射時間大大壓縮至數秒，大大提高了實驗效率。

縱觀組織病理和TEM，均未見到組織壞死。臨床上紅斑從第四天開始紅斑逐漸消退，最終10～14天徹底消退。臨床和病理及TEM結果均證明308 nm準分子激光照射的安全性。因為治療人體疾病時，產生MED的劑量，是比較好的治療劑量，過高，會造成水皰、色素沉著等不良反應，過低，會降低治療效果。此次，我們通過動物實驗，證明了MED劑量下產生的紅斑是安全的，可逆的。因此可以指導臨床醫師對治療劑量的把握。

同時，308 nm準分子激光照射后，組織病理下我們發現表皮和真皮水腫、增厚，表皮可見日曬傷細胞；真皮全層毛細血管擴張，血管周圍可見炎癥細胞浸潤。這一點與Koller等［10］和Ulrich等［11］利用紫外線（UltraViolet，UV）照射皮膚后通過反射性共聚焦顯微鏡（reflectance confocal microscopy，RCM）觀察到的體內實驗結果一致。Ulrich等［11］認為日曬傷細胞，小血管和毛細血管擴張取決于照射的UVB劑量，這一點有待于我們將來對比不同倍數的MED照射下組織病理改變以進一步驗證。除此之外，Xu等［12］研究低劑量UVB（200 mJ/cm2UVB，FLl20SE燈）照射rf2基因正常和缺陷小鼠耳朵背側，36 h后活檢在rf2基因正常小鼠耳背也發現了類似的結果，而血管充血水腫等在第三天達到高峰，第四天后開始消退。我們在該實驗中發現72～96 h兔耳的紅斑充血反應最重，因此選擇96 h后取活檢。

另外，Avila Acevedo等［13］以SKH-1無毛裸鼠為研究對照，測試 6 mJ/cm2的UVB燈（302 nm，26.6 W）照射裸鼠10 min后造成急性光損傷；24 h后病理結果證明，未經保護的無毛裸鼠出現日曬傷細胞，上皮變薄，真皮血管充血，此實驗與我們的實驗結果類似，但我們觀察到表皮充血增厚，與其結果不同。同時UVB光源、照射劑量與MED的相關性，都與我們的實驗不同。為了進一步了解308 nm準分子激光照射后超微結構改變，除了組織病理，我們還進行了TEM的研究，除了發現真皮血管擴張，血管周圍炎癥細胞浸潤，紅細胞外滲；還進一步觀察到有的毛細血管腔狹窄，血管內皮細胞和周細胞細胞核形態異型，關于TEM下的各種表現，未在其他相關文章中報道。

因此，通過本實驗，證明了308 nm準分子激光作為新的UVB光源，具有操作迅速簡單、高效準確、穩定性、可重復、安全的特點，本研究的結果，除了補充308 nm準分子激光照射人體產生的MED研究不足之外，將來主要是打算采用308 nm準分子激光作為新的UVB光源進行光敏感相關實驗，或作為高效穩定的光源，進行防曬產品防護性能的測定等研究，此研究結果只是這些實驗前期的基礎研究。

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（收稿：2016-03-15 修回：2016-04-15）

Determination of minimum erythema dose on rabbit ear irradiated by 308 nm excimer laser

YUE Xueping1，2，WANG Hongwei2.
1.Department of Dermatology and Venereology，Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China；2.Department of Dermatology and Venereology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China
Corresponding author：WANG Hongwei，E-mail：wanghw@pumch.cn

Objective：To determine the minimum erythema dose（MED）on rabbit ear irradiated by 308 nm excimer laser.Methods：The left ears of 30 rabbits were irradiated with the 308 nm eximer laser and the right ears were taken as the negative controls.The irradiation doses of the eximer laser on the left ears were 150，300，450，600，900 and 1350 mJ/cm2.Then the average MED after 24 h，48 h and 72 h in 30 rabbitswas calculated，and the micro-structure was observed under transmission electron microscopy（TEM），at 96 h after irradiation.Results：The average MED after 24 h，48 h and 72 h was 300±55.39 mJ/cm2.Compared with non-irradiated areas，the MED area after 96 h irradiation showed that the epidermis and dermis were thick，edema，and angiotelectasis.The blood vessels were infiltrated with lots of inflammatory cells.Under TEM，in the MED area irradiated after 96 h，there were degeneration and disorganization of collagen fibres，and fibrocyte organelle was coalesced presenting as crumby degeneration.Around blood vessels there was infiltration with inflammatory cells and erythrocyte exosmosis.Erythema gradually regressed in 96 h and disappeared in 10-14 days，without any large area of necrosis in pathology and TEM.Conclusion：308 nm eximer laser is highly stability and safety.

308 nm excimer laser；MED；sunscreen

1中國醫學科學院北京協和醫院皮膚性病科，北京，100050

2首都醫科大學附屬北京天壇醫院皮膚性病科，北京，100730

王宏偉，E-mail：wanghw@pumch.cn