伸筋易骨矯形手法對兔膝關節軟骨細胞代謝及Sox9表達的影響*

趙　強，王一洲

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伸筋易骨矯形手法對兔膝關節軟骨細胞代謝及Sox9表達的影響*

趙強，王一洲

（天津市中醫藥研究院附屬醫院推拿科，天津300120）

［目的］探討伸筋易骨矯形手法對兔膝關節軟骨細胞代謝及Sox9表達的影響。［方法］將膝骨關節炎（KOA）模型兔隨機分為3組，治療組采用伸筋易骨矯形手法治療，對照組采用關節腔注射玻璃酸鈉治療，模型組不做干預，同條件飼養，取材后分離膝骨關節軟骨細胞體外培養，鏡下觀察并通過四甲基偶氮唑鹽比色法（MMT）對比3組軟骨細胞增殖情況；通過蛋白免疫印跡分析3組軟骨細胞Sox9的表達變化。［結果］鏡下觀察治療組、對照組關節軟骨的增殖速度均快于空白組，其中治療組增殖速度最快，MMT法檢測治療組軟骨細胞增殖能力高于對照組（P＜0.05），蛋白免疫印跡分析顯示治療組Sox9表達高于對照組（P＜0.05）。［結論］伸筋易骨矯形手法具有提高軟骨細胞增殖速度，增強軟骨細胞增殖能力，同時該手法可以提高損傷軟骨組織Sox9的表達水平，從而促進軟骨細胞的合成代謝。

伸筋易骨矯形手法；膝關節；軟骨細胞代謝；Sox9

膝骨關節炎（KOA）是一種常見的以關節軟骨損害為特征的退行性骨關節病，雖然KOA發病機制的許多細節仍不明確，但大量研究顯示KOA的病情發展與軟骨細胞分解和合成代謝的失調相關。Sox9基因是一種轉錄激活因子，可以介導并參與多條信號通路促進軟骨細胞的增殖和分化［1］，Sox9基因的作用貫穿KOA的整個病程，是緩解軟骨退變和促進軟骨修復的關鍵基因。

臨床研究顯示伸筋易骨矯形手法可以調節KOA患者膝關節周圍軟組織功能、緩解臨床癥狀，因此本實驗以伸筋易骨矯形手法治療KOA模型兔，對比臨床常用的關節腔注射玻璃酸鈉，研究該手法對Sox9基因表達的調節作用，驗證其促進軟骨組織修復的作用機制，為臨床提供安全有效的治療手法提供依據。

1　材料與方法

1.1試劑DMEM培養液（Gibco公司，美國）、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美國）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司，美國）、二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁公司，中國）、Sox9抗體（Abcam公司，美國）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，中國）、組織和細胞總蛋白提取試劑盒（江萊公司，中國）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（碧云天公司，中國）、辣根過氧化物標記二抗（Jackson公司，美國）。

1.2儀器酶標分析儀（BioTek公司，美國）、二氧化碳培養箱（Sanyo公司，日本）、超凈臺（蘇州凈化設備公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）、電泳系統（Bio-Rad公司，美國）、化學發光成像系統（Uvitec公司，英國）。

1.3模型采用改良Hulth模型構建30只KOA兔模型［北京維通利華SCXK（京）05076685］，健康6～8月齡，體質量3～3.5 kg，雌雄各半，將30只兔編號后按隨機數字表法隨機分成3組，治療組采用伸筋易骨矯形手法治療，對照組采用關節腔注射玻璃酸鈉注射液治療，模型組造模后同條件、同期飼養。

Hulth模型制作方法［2］：右側后腿上方靠近尾部備皮，3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，仰臥位固定下肢，從膝關節內側切開2 cm顯露膝關節，將髕骨推向外側，牽開關節暴露前交叉韌帶并切斷，同時切斷內側副韌帶和內側半月板，縫合皮膚和皮下組織，沖洗關節腔，術后給予口服止痛藥及抗生素，1周后開始驅趕每日0.5 h，連續30 d。

1.4治療方法治療組［3］：1）將造模后的兔仰臥位固定，指揉股四頭肌，髕骨周圍，約5 min，按揉鶴頂、血海、梁丘、伏兔等穴，每穴1 min。2）彈撥髕韌帶、髂脛束、股四頭肌肌腱附著處，并提拿髕骨。3）膝關節搖法1 min，配合被動屈伸。4）擦法1 min，結束手法。以上手法治療每日1次，7 d為1個療程，共治療3個療程。對照組：1）仰臥位固定下肢，常規消毒。2）髕骨外側緣下方凹陷處進針注入玻璃酸鈉（每只5 mg，相當于成人用量）。3）紗布蒙蓋注射區每周1次，共治療3周。空白組：造模后同條件、同期飼養。

1.5KOA軟骨細胞的分離、培養靜脈空氣栓處死動物。截取脛骨面軟骨組織，洗去血污雜質，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗2次后，剪切至1 mm3大小的碎塊，移入超凈臺。加入2.5 g/L的胰蛋白酶5 mL，磁力棒搖蕩消化40 min，吹打棄上清，加入5 mL的0.025%Ⅱ型膠原酶，恒溫震蕩箱放置4～6 h。收集分離細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，將液溶解的細胞放入DMEM液中使細胞懸液均勻分布，反復吹打，將軟骨細胞接種在25 cm2的培養皿中，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）培養箱中。逐日觀察，2～3 d換1次液，原代細胞長滿后傳代，取2代細胞作實驗用［4］。

1.6MTT測骨關節炎軟骨細胞增殖3組細胞接種在96孔板中，接種密度2×104個細胞/cm2，隔日換液。培養16 d后取出一塊96孔板進行檢測，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續孵育4 h，加入100 μL DMSO溶解結晶，置酶標儀570 nm波長測定吸光度值。

1.7蛋白免疫印跡法檢測將3組軟骨組織按照總蛋白提取試劑盒說明書要求提取總蛋白，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒和光吸收酶標儀測定蛋白濃度。100℃水浴3 min，加入蛋白上樣緩沖液，充分混合并離心至管底，將蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，設定管家基因β-actin為內參。置入電泳槽，加轉膜緩沖液，電泳槽置冰盆中，350 mA，60 min轉膜，洗膜液（1 000 mL，PBS+1 mL，吐溫-20）漂洗3次，每次10 min。聚偏二氟乙烯膜（PVDF）置一抗中孵育，搖床上4℃，過夜，辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜液漂洗3次，每次10 min。ECL發光試劑盒中A液和B液按照1∶1混合搖勻，條帶在化學發光成像系統中顯影，通過灰度分析比較Sox9蛋白產物在3組軟骨細胞中的表達情況［5-6］。

1.8觀察指標1）3組軟骨細胞的增殖情況。2）3組軟骨細胞Sox9基因的表達水平。

1.9統計學方法采用SPSS18.0統計軟件包對數據進行統計學分析，計量資料使用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

3組細胞48 h后完全貼壁，對照組原代細胞貼壁較治療組晚，且對照組原代細胞繁殖速度較治療組慢，治療組原代細胞6 d后基本長滿瓶壁，多為單層生長，見圖1。

圖1　原代關節軟骨細胞培養6 d（×100）Fig.1　Primary articular cartilage cells 6 days after cultured（×100）

MMT對比3組軟骨細胞組的增殖變化，見表1。3組軟骨細胞吸光值對比，結果表明治療組與對照組軟骨細胞增殖的水平均高于空白組軟骨細胞（P＜0.05），治療組軟骨細胞增殖的水平高于對照組軟骨細胞（P＜0.05）。提示伸筋易骨矯形手法能提高軟骨的增值能力，更好的幫助損傷的軟骨組織修復。

表1　MMT比較3組軟骨細胞的增殖變化（x±s）Tab.1　Comparison of the proliferation changes of chondrocytes detected by the MTT assay between two group（

表1　MMT比較3組軟骨細胞的增殖變化（x±s）Tab.1　Comparison of the proliferation changes of chondrocytes detected by the MTT assay between two group（

注：與空白照相比，*P＜0.05；與對照組相比，#P＜0.05。

組別治療組對照組空白組OD570值0.237±0.013#0.192±0.014* 0.072±0.012

蛋白免疫印跡法實驗結果顯示，治療組細胞均有Sox9蛋白表達。通過灰度分析后結果顯示，治療組軟骨細胞Sox9蛋白表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖2。

圖2　3組軟骨組織Sox9蛋白表達的免疫印跡檢測對比Fig.2　Expression of Sox9 protein compared of cartilages organize by Western blot among 3 groups

3　討論

關節畸形是KOA病程后期患者的主要癥狀，患者下肢力線偏移、關節活動能力下降、關節周圍軟組織退變，最終導致全膝關節功能喪失，關節畸形是KOA致殘的主要病理因素［7-8］。目前對糾正KOA關節畸形的主要手段是全膝關節置換術和膝關節矯形支架，這兩種術式通過矯正下肢力線，調節膝關節周圍軟組織的相應關系達到正畸作用，但此類手術治療費用昂貴、手術禁忌癥和并發癥較多［9-10］。推拿作為一種以體表軟組織為主要施術部位的保守治療手段，可以增強股四頭肌肌力［11］，調節股四頭肌和腘繩肌肌張力［12］，緩解關節疼痛及水腫，從而矯正下肢力線達到正畸療效［13］。

伸筋易骨矯形手法治療膝關節骨性關節炎已在臨床應用了近十年，臨床研究顯示，伸筋易骨矯形手法可以明顯提升KOA患者膝關節周圍軟組織功能，改善軟骨組織的生長環境，調節軟骨細胞合成代謝，從根本上防治KOA。本實驗研究該手法防治KOA的作用機制，結果可顯示手法和針劑對促進軟骨細胞修復均有一定作用，筋易骨矯形手法能夠更好的上調Sox9的表達，促進細胞合成代謝，加快組織修復。

Sox是一組與胚胎軟骨早期發育的相關基因家族，在軟骨的發育成熟過程中發揮非常關鍵的調控作用［14-15］，與軟骨形成分化關系較為密切的主要有3種Sox蛋白亞型，Sox9是促進軟骨分化的關鍵轉錄因子。細胞生長因子和理化刺激通過各種信號通路，激活Sox9的轉錄和翻譯，進而激活下游Sox5、Sox6，Sox9與Sox5、Sox6等蛋白的表達，誘導成軟骨分化特異性基因的轉錄和表達，從而形成軟骨，因此Sox9被稱為成軟骨分化的“分子開關”［17］。其中Sox9是軟骨間質細胞和軟骨前體細胞募集過程中重要的調控因子［17］，Sox9主要是在靜止層和增殖層軟骨細胞中表達，維持軟骨細胞表型并協同抑制細胞的終末分化，通過與基因表達調控的增強子元件相結合而增強Ⅱ型膠原基因表達，促進軟骨細胞外基質的合成［18］。手法治療上調Sox9的表達，可能是修復軟骨組織、治療KOA的一個原因。

《醫宗金鑒》對推拿手法的總結有“摸、接、端、提、推、拿、按、摩”8法，伸筋易骨矯形手法對膝痹的“氣血郁滯，為腫為痛”，施以“按其經絡，以通郁閉之氣，摩其壅聚，以散郁結之腫”。通過手法緩解膝周肌肉緊張度，松解髕周軟組織粘連，改善脛骨上段、股骨下段及髕骨周圍的血液循環，調整關節周圍軟組織張力，進而改善軟骨細胞生長環境，修復受損軟骨組織。

綜上，本實驗證實，伸筋易骨矯形手法可提高軟骨細胞增殖速度，上調Sox9表達，調節軟骨組織合成代謝，從而改善KOA癥狀。

［1］趙強，王一洲.膝骨性關節炎的模型建立及軟骨細胞培養的研究進展［J］.天津中醫藥大學學報，2013，32（1）:58-60.

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（本文編輯：馬英，高杉）

《天津中醫藥》和《天津中醫藥大學學報》再次入選中國科技核心期刊

2015年10月21日，科技部中國科學技術信息研究所（ISTIC）在北京國際會議中心舉行中國科技論文統計結果新聞發布會暨《2015年版中國科技期刊引證報告（核心版）》發布會。天津中醫藥大學主辦的《天津中醫藥》和《天津中醫藥大學學報》兩刊均再次入選“中國科技核心期刊”（中國科技論文統計源期刊）

據悉，《2015年版中國科技期刊引證報告（核心版）》中，《天津中醫藥》屬于中醫學類和中藥學類期刊，2014年核心影響因子0.691、排名第6，核心總被引頻次1528、綜合評價總分41.6、總排名第19。《天津中醫藥大學學報》屬于中醫藥大學學報類期刊，2014年核心影響因子為0.856、排名第1，核心總被引頻次659、綜合評價總分47.3、總排名第6，取得了歷次期刊評價中的最好成績。

自1987年以來，中國科學技術信息研究所每年定期公布中國科技論文發表狀況和趨勢，并在此基礎上拓展到中國專利、科技期刊、學術圖書等領域產出情況的統計分析。2015年統計報告包括我國發表的國際論文數量、國際論文被引用情況、國內發表論文數量、國內論文被引用情況、我國各學科領域論文分布和影響、我國各地區論文分布和影響、我國各類型機構論文分布和影響、我國國際合著論文情況、我國高影響科技論文情況、我國科技期刊有關指標的統計分析以及我國出版社引證報告。

Effects of Shenjin Yigu orthopaedic manipulation on chondrocytes metabolism and the expression of Sox9 in rabbits

ZHAO Qiang，WANG Yi-zhou
（Department of Massage，Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，Tianjin 300120，China）

［Objective］To study the effects of Shenjin Yigu orthopaedic manipulation on rabbit chondrocytes metabolism and the expression of Sox9.［Methods］KOA rabbits were randomly divided into 2 groups.The treatment group used Shenjin Yigu orthopaedic manipulation therapy，the control group using intra-articular injection of sodium hyaluronate，culturing chondrocytes in vitro after drawing materials.Microscope observation and comparing of chondrocytes’proliferation between two groups by MMT method，analyzing the expression of Sox9 of chondrocytes between two group by Western-blot method.［Results］Microscopic observation of the treatment group and control group of chondrocytes proliferation faster than those in the blank group and the multiplicaion rate of the treatment group was fastest than those in the control and blank groups，and better proliferation of chondrocytes in the treatment group than that in the control group detected by MMT method（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the expression of Sox9 was higher in the treatment group than that in the control group（P＜0.05）.［Conclusion］Shenjin Yigu orthopaedic manipulation can improve the speed of proliferation of chondrocytes，enhancing chondrocytes’multiplication ability.Simultaneously this manipulation can increase the expression level of Sox9 in injured cartilage tissue，to promote the synthesis of chondrocyte metabolism ability.

Shenjin Yigu orthopaedic manipulation；knee joint；chondrocyte metabolism；Sox9

R684

A

1672-1519（2016）02-0096-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.09

國家自然科學基金資助項目（81473795）。

趙強（1968-），男，主任醫師，主要從事骨關節病的臨床和基礎研究。

（2015-10-08）