梔子苷預處理對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響及機制研究*

蔡智慧，尹　麗，常全忠

梔子苷預處理對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響及機制研究*

蔡智慧，尹麗，常全忠

（漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，漯河462002）

［目的］探討梔子苷預處理對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響及機制。［方法］體外培養H9C2心肌細胞，制備缺氧/復氧損傷模型。實驗分為正常對照組，缺氧/復氧模型組，梔子苷預處理組。分光光度法測定細胞培養液中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量以及過氧化物歧化酶（SOD）活性，四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞存活率，Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術測定細胞凋亡率。［結果］與模型組比較，梔子苷預處理組能明顯減少心肌細胞CK、LDH的漏出量，提高SOD活力，降低MDA含量，同時提高心肌細胞的存活率，減少心肌細胞的凋亡。［結論］梔子苷預處理對H9C2心肌細胞的缺氧/復氧損傷具有保護作用，其機制可能與增強心肌抗氧化能力、清除氧自由基以及抑制心肌細胞凋亡有關。

梔子苷；心肌細胞；缺氧/復氧損傷

梔子苷（GE）是從茜草科植物梔子的干燥成熟果實中提取出來的一種環烯醚萜苷類化合物［1］，具有多種藥理作用。近年來，眾多動物及臨床實驗證實梔子苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、清熱消毒等藥效，是治療心腦血管、肝膽以及神經疾病等的原料藥物［2］。但是，關于梔子苷對缺氧/復氧心肌細胞的作用目前研究的不多，因此本實驗通過體外培養H9C2心肌細胞，建立缺氧/復氧損傷模型，觀察梔子苷預處理對心肌細胞肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響，以及對心肌細胞存活率和凋亡的影響，為中藥在臨床上的進一步應用提供實驗依據。

1　　材料和方法

1.1細胞株H9C2心肌細胞株購于北京中醫科學院細胞中心。

1.2主要儀器和試劑二氧化碳（CO2）培養箱（Thermo公司），倒置熒光顯微鏡（Olympus公司），分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），Multiskan FC酶標儀（Thermo公司），流式細胞儀（美國BD公司），梔子苷（中國藥品生物制品檢定所），胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM培養基（Solarbio公司），LDH、CK、SOD和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），四甲基偶氮唑藍（MTT，Sigma公司），Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（Sigma公司），其余試劑均為分析純。

1.3缺氧/復氧模型制備參考文獻方法并進行改進。取對數生長期的心肌細胞接種至24孔培養板內，待細胞長至80%融合狀態時，棄去原培養液，加入不含FBS的無糖培養基。將培養板放入通有95%氮氣（N2）和5%CO2混合氣體的缺氧盒內，37℃培養4 h，然后換成正常培養基在常氧條件下繼續培養12 h。

1.4實驗分組將生長狀態良好的心肌細胞隨機分為3組：1）正常對照組：加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，正常培養。2）缺氧/復氧模型組：缺氧4 h，復氧12 h，具體造模方法同上。3）梔子苷預處理組：造模前2 h加入用正常培養液配制的梔子苷，其余處理同缺氧/復氧模型組。

1.5細胞培養液中LDH、CK、SOD、MDA的測定缺氧/復氧模型建立成功后，按照試劑盒提供的方法取心肌細胞培養上清液，利用分光光度法測定上清液中LDH、CK、SOD、MDA的含量。

1.6MTT法檢測心肌細胞存活率造模結束后棄上清，每孔加入MTT10 μL，DMEM培養基90 μL，共孵育4 h后棄去培養液，加150 μL二甲基亞砜（DMSO），充分震蕩，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度。以不含細胞，只含培養基和MTT的孔為本底對照組，每組設5個復孔，實驗重復3次。細胞存活率＝（OD實驗組-OD本底對照組）/（OD正常對照組-OD本底對照組）×100%

1.7采用流式細胞方法檢測細胞凋亡率造模結束后將心肌細胞用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶進行消化，再用預冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，4℃1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer重懸細胞，加入AnnexinV-FITC 10 μL和PI 5 μL混勻，避光室溫反應15 min，1 h內上機檢測。

1.8統計學分析使用SPSS18.0統計軟件，所有實驗數據用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1細胞培養液LDH、CK、SOD、MDA的測定如表1所示，模型組心肌細胞生成LDH、CK、MDA較正常對照組明顯升高（P＜0.01），SOD活性則較正常對照組明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，梔子苷可使LDH、CK、MDA減少（P＜0.01），SOD活性升高（P＜0.05）。結果說明梔子苷可以提高心肌細胞的抗氧化以及清除氧自由基的能力，減輕脂質過氧化反應，穩定心肌細胞膜，減少心肌酶的漏出。

表1　梔子苷對LDH、CK、SOD、MDA的含量的影響（x±s）Tab.1　Effects of geniposide to the contents of LDH，CK，SOD and MDA

表1　梔子苷對LDH、CK、SOD、MDA的含量的影響（x±s）Tab.1　Effects of geniposide to the contents of LDH，CK，SOD and MDA

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組　n　LDH　CK　SOD　MDA（U/L）　　（U/L）　（KN U/L）（μmol/L）正常對照組　8 24.26±5.37　15.23±4.52 46.55±7.84 1.57±0.52模型組　842.96±6.82**29.35±6.54**29.23±5.48**5.69±0.86**梔子苷預處理組 8 32.53±6.19##23.21±4.97##35.63±5.78#2.97±0.65##

2.2心肌細胞存活率的測定如表2所示，模型組心肌細胞存活率明顯低于正常對照組（P＜0.01），與模型組相比，梔子苷預處理組心肌細胞存活率則明顯提高（P＜0.01）。結果說明，梔子苷可以提高缺氧/復氧心肌細胞的存活率，起到保護作用。

表2　梔子苷對心肌細胞存活率的影響（x±s）Tab.2　Effects of geniposide to cell viability of myocardial cells

表2　梔子苷對心肌細胞存活率的影響（x±s）Tab.2　Effects of geniposide to cell viability of myocardial cells

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

分組　n　OD490 nm　　存活率（%）正常對照組　8　0.356±0.136　100.0±0模型組　8　0.178±0.045**　48.5±3.3**梔子苷預處理組　8　0.289±0.047##　80.2±5.9##

2.3心肌細胞凋亡的測定流式細胞儀檢測結果顯示，正常對照組、模型組、梔子苷預處理組的細胞凋亡率分別為1.2%，55.8%，15.3%。與正常對照組比較，模型組凋亡率顯著增加。與模型組相比，梔子苷預處理組的心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。說明梔子苷能顯著抑制缺氧/復氧心肌細胞的凋亡。結果見圖1。

3　討論

近年來，溶栓、PTCA等技術愈發成熟，然而缺血再灌注損傷的問題一直沒有得到有效解決，成為缺血性心臟病治療過程中的難題［4］。心肌缺血再灌注損傷的機制十分復雜，目前公認的主要有氧化應激、炎癥反應、鈣超載、細胞凋亡等［5］。

正常情況下，機體內存在著少量的自由基，可以被SOD及時清除，當缺血再灌注損傷發生時，SOD活性受到抑制，導致自由基大量產生，與細胞膜及生物大分子發生過氧化反應［6-7］。MDA是心肌細胞膜脂質過氧化的產物，大量的MDA破壞了細胞膜的完整性，使細胞內的心肌酶LDH、CK發生外漏。因此檢測SOD活性及LDH、CK和MDA的含量可以間接反映細胞膜受損傷的程度［8］。

圖1　梔子苷對心肌細胞凋亡的影響Fig.1　Effects of geniposide to the apoptosis of myocardial cells

梔子苷是從傳統中藥梔子中提取出來的一種環烯醚萜苷類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、清熱消毒、保肝利膽等多種藥理作用［9］。近年來，眾多動物及臨床實驗證實梔子苷具有心血管保護作用［10-11］，但具體機制尚不清楚。本實驗中，用缺氧/復氧細胞模型模擬體外心肌缺血/再灌注，結果顯示，與模型組相比，梔子苷預處理組SOD活性升高，LDH、CK以及MDA的含量減少。同時，MTT的結果顯示，梔子苷組心肌細胞的存活率明顯高于模型組，說明梔子苷可以提高機體清除氧自由基以及抗氧化能力，保護缺氧/復氧心肌細胞。

此外，心肌細胞在發生缺血再灌注的過程中，細胞內鈣超載、氧自由基的大量增多以及中性粒細胞的浸潤等都會誘發心肌細胞凋亡［12］。近年來，眾多研究者證實心肌細胞的凋亡是心肌缺血再灌注損傷產生過程中的一個重要事件，有效干預心肌細胞的凋亡對于防治心肌缺血再灌注損傷有著重要的意義［13］。本實驗結果顯示，模型組的心肌細胞凋亡明顯高于對照組，這和其他研究者的結果相一致，而進行梔子苷預處理則可以明顯降低心肌細胞的凋亡。

綜上所述，梔子苷對缺氧/復氧心肌細胞具有保護作用，其機制可能與梔子苷能增強心肌細胞抗氧化能力，清除氧自由基以及減少心肌細胞的凋亡有關。

［1］Wang J，Hou J，Lei H，et al.Synergistic neuroprotective effect of microglialconditionedmediatreatedwithgeniposideand ginsenoside Rg1 on hypoxia injured neurons［J］.Mol Med Rep，2015，12（4）:5328-5334.

［2］Chen JY，Wu H，Li H，et al.Anti-inflammatory effects and pharmacokinetics study of geniposide on rats with adjuvant arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2015，4（1）:102-109.

［3］關欣，李應東.細胞缺氧復氧模型建立方法的研究進展［J］.醫學綜述，2008，14（18）：2737-2739.

［4］蔡智慧，鄭亞萍.冠心蘇合丸對乳鼠心肌細胞缺血再灌注損傷的作用［J］.廣州中醫藥大學學報，2013，30（5）:722-724.

［5］Meng G，Wang J，Xiao Y，et al.GYY4137 protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by attenuating oxidative stress and apoptosis in rats［J］.J Biomed Res，2015，29（3）:203-213.

［6］Kalra J，rasad K.Oxygen free radicals and cardiac depression［J］. Clin Biochem，1994，27（3）:163-168.

［7］劉紅旭，李愛勇，解欣然，等.參元丹后處理對心肌缺血/再灌注大鼠血清MDA、SOD水平的影響［J］.微循環學雜志，2011，21（1）: 1-5.

［8］許大慶，雷婕，彭曉東，等.大豆苷元對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用［J］.寧夏醫學院學報，29（4）:344-346.

［9］游偉良，平其能，孫敏捷.梔子苷的藥理學研究新進展［J］.藥學進展，2012，36（4）：158-162.

［10］王志超，楊小龍，張珂，等.梔子苷藥理作用的研究進展［J］.河南科技大學學報（醫學版），2012，30（2）:159-160.

［11］Liu W，Li G，Holscher C，et al.Neuroprotective effects of geniposide on Alzheimer’s disease patpathology［J］.RevNeurosci，2015，26（4）: 371-383.

［12］Zhu L，Wei T，Gao J，et al.The cardioprotective effect of salidroside against myocardial ischemia reperfusion injury in rats by inhibiting apoptosis and inflammation［J］.Apoptosis，2015，20（11）:1433-1443.

［13］盧新華，韓瑛，王桂霞.馬齒筧總黃酮對缺氧/復氧致心肌細胞損傷的影響及機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：226-230.

（本文編輯：高杉，于春泉）

Effects and mechanism of geniposide pretreatment on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury

CAI Zhi-hui，YIN Li，CHANG Quan-zhong
（Department of Basic Medicine，Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

［Objective］To explore the effects and mechanism of geniposide pretreatment on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/ reoxygenation injury.［Methods］H9C2 cardiomyocytes were cultivated in vitro and the model of hypoxia/reoxygenation injury was established.The cells were randomly divided into 3 groups:the control group，hypoxia/reoxygenation injury group and the geniposide pretreatment group.The contents of CK，LDH，MDA and the activity of SOD were evaluated by spectrophotometric method.The cell viability was measured with MTT.The apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC/PI staining.［Results］Compared with the hypoxia/ reoxygenation injury group，the geniposide pretreatment group can reduce the concentration of CK，LDH and MDA，improve the activity of SOD in myocardial tissue，improve the cell viability and reduce the apoptosis rate.［Conclusion］The geniposide has protective effects on hypoxia/reoxygenation injury，which are associated with scavenging free radical，enhancing the capacity of antioxidation and inhibiting cadioocyte apoptosis.

geniposide；cardiomyocyte；hypoxia/reoxygenation injury

R285.5

A

1672-1519（2016）02-0111-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.02.13

河南省教育廳高等學校重點科研項目（16A180031）。

蔡智慧（1983-），女，碩士，講師，主要從事生理學教學和科研工作。

常全忠，E-mail：cqzchang@tom.com。

（2015-10-21）