分子印跡固相萃取超高效液相熒光法測定螺類中多環芳烴

胡　園，鄭伊諾，陸榮茂，許凱倫，曾國權，黃建東，潘齊存（浙江省海洋水產養殖研究所浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江溫州 325005）

分子印跡固相萃取超高效液相熒光法測定螺類中多環芳烴

胡園，鄭伊諾，陸榮茂，許凱倫，曾國權，黃建東，潘齊存
（浙江省海洋水產養殖研究所浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江溫州 325005）

建立分子印跡固相萃取結合超高效液相熒光法測定螺類中15種多環芳烴的方法。樣品經正己烷提取，用MIP-PAHs多環芳烴專用固相萃取小柱（SPE）凈化，熒光檢測器定量檢測。15種多環芳烴在方法線性范圍為1～100 ng·m L-1，相關系數大于0.999，在不同的添加水平（5、10、20μg·kg-1）下，PAHs各組分的平均回收率在73.07%～108.06%，相對標準偏差為0.6%～9.2%。檢測浙江省內部分地區螺類中15種PAHs總含量值范圍為17.20～107.26μg·kg-1，螺類樣品的PAHs優勢組分為三環結構，六環結構的PAHs未檢出。

分子印跡固相萃取；超高效液相熒光法；多環芳烴；螺類

文獻著錄格式：胡園，鄭伊諾，陸榮茂，等.分子印跡固相萃取超高效液相熒光法測定螺類中多環芳烴［J］.浙江農業科學，2016，57（7）：1137-1140，1155.

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）類化合物是一種惰性較強的碳氫化合物。PAHs具有疏水性、半揮發性及難降解等特點，容易在生物體內富集［1-3］。PAHs能夠抑制植物的生長，對人類有明顯的“三致”效應（致癌、致畸、致突變），已成為世界的研究熱點［4-5］。由于我國工業化及城市化的快速發展，燃煤、燃油被廣泛地應用，產生的污染物不斷排入水域中，對漁業養殖帶來很大的危害，并影響到水產品的出口和我國人民的身體健康。

貝螺類具有營濾食性生活和代謝率低的特點，極易富集污染物，常用作海洋生態系統污染暴露于效應的生物指示。PAHs在環境中不易降解并且具有親脂特性，經鰓絲、體表滲透和攝食等方式進入海洋生物，環境中PAHs的生物富集系數可高達幾千至幾百萬倍，因此海洋貝螺類已廣泛地應用于海洋環境中有機污染物的檢測［6-7］。

分子印跡技術是借助人工制備的分子印跡聚合物（molecu1arly imprinted polymer，MIP）針對目標分子實施特異性識別、分離、凈化以及富集處理，同時多種MIP和SPE柱結合起來的應用，通過分子印跡材料能夠避免到內源性干擾，在有效去除樣品基質干擾的同時，還可以特異性結合分析物［8］。本研究利用分子印跡固相萃取-超高效液相熒光色譜法測定螺類中多環芳烴的含量，并綜合分析浙江省內部分地區螺類體內PAHs的殘留現狀、含量水平及PAHs的組分特征。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

H-CLASS型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；MG-2200型氮吹儀（日本EYELA公司）；QT-1型漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；12位固相萃取真空裝置（德國CNW科技公司）；SB-5200DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5810R型離心機（德國Eppendorf公司）；電子天平（德國bt25s公司）；MIP-PAHs多環芳烴專用小柱（上海安譜科技股份有限公司），填料規格為1 g·（6 m L）-1；親脂PTFE針式濾器。

乙腈（色譜純），正己烷（色譜純），二氯甲烷（色譜純）；15種多環芳烴混合標液：萘（Nap）、苊（Ace）、芴（F1u）、菲（Phe）、蒽（Ant）、熒蒽（F1n）、芘（Pyr）、苯并（a）蒽（BaA）、（Chr）、苯并［b］熒蒽（BbF）、苯并［k］熒蒽（BkF）、苯并［a］芘（BaP）、茚苯［1，2，3-cd］芘（Inp）、二苯并［a，n］蒽（DahA）、苯并［g，h，i］芘（BghiF），濃度為200 mg·L-1。

1.2樣品預處理

1.2.1試樣提取

稱取5 g均質（精確至0.01 g）試樣于50 m L離心管A，加入10 m L正己烷，渦旋振蕩10 s后，放入40℃超聲水浴30 min，4 500 r·m in-1離心5 min，吸取上清液于30 mL玻璃離心管B中，再加入10 m L正己烷重復提取操作一次。合并兩次上清液，待凈化。

1.2.2試樣凈化

依次用5 m L二氯甲烷、5 m L正己烷活化M IPPAHs多環芳烴專用小柱，將待凈化樣上到小柱上，再用2 m L正己烷潤洗30 m L玻璃離心管B，上樣到柱上，用6 mL正己烷淋洗小柱并棄流出液，再用6 m L二氯甲烷收集洗脫液于5 m L玻璃離心管中，將收集液在40℃下用氮氣吹干，用1 m L乙腈定容，超聲1 m in，再漩渦混合10 s，過0.22μm親脂PTFE針式濾器，待上機檢測。

1.2.3測定

取試樣溶液10μL，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖，從標準曲線上查得樣品中多環芳烴的濃度。

1.3色譜條件

色譜柱為Aglient ZORBAX Eclipse PAH柱（4.6 mm×150 mm，3.5μm），柱溫30℃；流動相A為乙腈，B為超純水。洗脫梯度為0.0～2.0 min，50%A；2.0～22.0 m in，50%～100%A；22.0～28.0 min，100%A；28.0～28.1 m in，100%～50%A；28.1～32 m in，50%A；流速為1.5 m L·m in-1。

多波長熒光檢測器，采用程序定時控制熒光檢測波長變化，測定除苊烯以外的15種多環芳烴，見表1。

1.4結果計算

15種多環芳烴含量的計算公式：

X/（μg·kg-1）=C·V·1000/m。

其中，X為樣品的多環芳烴含量，μg·kg-1；C為從標準工作曲線中得到的待測液中多環芳烴的濃度，μg·m L-1；V為待測液體積，m L；m為試樣質量，g。

表1　PAHs的熒光檢測程序

2　結果與分析

2.1標準曲線線性范圍

配置1、5、10、20、50和100 ng·m L-1系列標準工作溶液，以待測物的濃度X（ng·m L-1）為橫坐標，待測物的峰面積Y為縱坐標制作標準曲線，得到PAHs的回歸方程和相關系數。由表2可知，PAHs在1～100 ng·mL-1其標準曲線的線性關系良好，可滿足定量分析的要求。

表2　15種PAHs的線性范圍、線性方程、相關系數

2.2回收率與精密度

為了確保分析數據的準確性、精密性和可比性，在空白螺類樣品中添加含有15種PAHs的混標（添加水平分別為5、10、20μg·kg-1），每個添加水平進行3次實驗，與未加標的樣品進行同樣的實驗操作流程，最終經過色譜分析得到含有混標的樣品譜圖與沒加標的空白樣品譜圖。從表3可知，5～20μg·kg-1加標水平時，樣品15種PAHs的平均加標回收率為73.07%～108.06%；相對標準偏差（RSD）均小于10%。

2.3浙江省內部分地區多環芳烴的含量水平

運用本研究建立的方法對浙江省內部分地區的螺類樣品進行分析檢測。

檢測分析結果（表4）表明：15種組分中Phe的平均含量最高，檢測樣品中Phe的含量在5.83～30.21μg·kg-1；Nap的平均含量為8.44μg· kg-1；BkF、BaP、BaA、BghiP和InP在被測螺類中均未檢出。

表3　PAHs空白樣品中的平均加標回收率（n=3）

表4　浙江省部分地區螺類中多環芳烴的含量μg·kg-1

浙江省內部分地區的螺類樣品中多環芳烴平均含量見圖1?？芍瑴刂荻搭^被測樣品的PAHs總和含量最高，平均含量約為57.02μg·kg-1；其次臺州椒江和溫州蒼南的PAHs含量分別為48.45、41.10μg·kg-1；臺州三門和舟山普陀的PAHs平均含量分別為39.28、37.15μg·kg-1。

圖1　浙江省內部分地區多環芳烴平均含量

圖2　總體組分結構

圖3　浙江省內部分地區多環芳烴組分特征

2.4浙江省內部分地區螺類多環芳烴的組分特征分析

PAHs大致可分為2環的萘，3環的苊烯、苊、芴、非和蒽，屬于低分子質量多環芳烴，易揮發，對水生生物有一定毒性；4環的熒蒽、芘、苯并［a］蒽和艸屈，5環的苯并［b］熒蒽、苯并［K］熒蒽、苯并［a］芘、二苯并［a，h］蒽，6環的茚并［1，2，3-cd］芘、苯并［g，h，i］苝，屬于高分子質量多環芳烴，沸點較高，不易揮發，但具有致癌、致突變作用［9-10］。由圖2可知，本研究中螺類的多環芳烴優勢組分為3環結構約為47.41%，其次是4環結構為33.75%，6環結構未檢出。總的結構比例為3環＞4環＞2環＞5環＞6環。其中，低分子質量（2～4環的PAHs）占總含量的比例為99%以上。

浙江省內部分地區PAHs組分特征見圖3。2環PAHs是臺州三門和溫州洞頭被測螺類體內多環芳烴的優勢組分；臺州椒江被測樣品的PAHs以4環為優勢組分；舟山普陀的組分特征結構較平均，2、3、4環結構含量在5.41～5.87μg·kg-1；PAHs結構組成較豐富的是溫州洞頭，4種結構的組分都有。

3　討論

本研究建立了分子印跡固相萃取-超高效液相色譜熒光檢測15種多環芳烴含量的方法，具備了操作步驟簡單、回收率穩定、結果準確的優點。超聲波提取法增強了溶劑穿透復雜基質，對水產品中PAHs的分析更有優勢。PAHs在1～100 ng·m L-1其標準曲線的線性關系良好；在不同的添加水平下，PAHs各組分的平均回收率在73.07%～109.73%，相對標準偏差為0.6%～9.2%。

浙江省內部分地區螺類中15種PAHs總含量約為17.20～107.26μg·kg-1，15種PAHs組分中Phe的平均含量最高，其含量在5.83～30.21μg· kg-1；BkF、BaP、BaA、BghiP和InP在被測螺類中均未檢出。其中，溫州洞頭被測樣品的PAHs含量最高，平均含量約為57.02μg·kg-1。

本研究中螺類樣品的多環芳烴優勢組分為2環結構，而6環結構均未檢出。2～4環的PAHs含量占總含量的比例為99%以上。PAHs結構組成較豐富的是溫州洞頭，4種結構的組分都有。

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（責任編輯：萬 晶）

S 949；O 657.7

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0528-9017（2016）07-1137-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160757

2016-04-12

海水養殖貝類?；钸^程中生化特性的研究及其鮮度評價（2015C32037）；飛云江入?？陉懺次廴緦ω愵愷B殖的影響及貝類質量安全風險預警技術研究（2015F30021）；2013年度省級公益性技術應用研究社會發展項目（2013C2059）

胡 園（1988—），女，工程師，碩士研究生，從事水產品質量安全與檢測工作，E-mai1：75838180@qq.com。