棘胸蛙白內(nèi)障病原鑒定及藥敏試驗(yàn)

程曉云，鄭芊芷，宋婷婷，鄭善堅(jiān)*，鄭榮泉（.浙江師范大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，浙江金華 2004；2.遂昌縣森林資源管理總站，浙江麗水 200；.浙江師范大學(xué)附屬中學(xué)浙江金華 2004）

棘胸蛙白內(nèi)障病原鑒定及藥敏試驗(yàn)

程曉云1，2，鄭芊芷3，宋婷婷1，鄭善堅(jiān)1*，鄭榮泉1
（1.浙江師范大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，浙江金華 321004；2.遂昌縣森林資源管理總站，浙江麗水 323300；3.浙江師范大學(xué)附屬中學(xué)浙江金華 321004）

從患病棘胸蛙（Quasipaa spinosa）中分離到BN1306菌株，經(jīng)肌肉注射回健康棘胸蛙，復(fù)制出棘胸蛙白內(nèi)障病的基本癥狀，并顯示對棘胸蛙有較強(qiáng)的致病性。通過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA測序等方法鑒定該致病菌為布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）。藥敏試驗(yàn)顯示該菌對諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、吡哌酸高度敏感，對氟哌酸、頭孢哌酮、慶大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素和紅霉素不敏感。

棘胸蛙；布氏檸檬酸桿菌；白內(nèi)障

文獻(xiàn)著錄格式：程曉云，鄭芊芷，宋婷婷，等.棘胸蛙白內(nèi)障病原鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1141-1143，1151.

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）主要分布于我國長江以南地區(qū)，是一種兼具食用和藥用價(jià)值的蛙類［1］。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度提高、不合理的飼養(yǎng)管理以及種質(zhì)衰退等原因，棘胸蛙病害時(shí)有發(fā)生。蘇雪紅等［2］調(diào)查發(fā)現(xiàn)棘胸蛙的病害包括白內(nèi)障、爛皮病、紅腿病、脹肚病、出血病等10余種主要疾病，但相關(guān)病原的研究報(bào)道較少。王瑞君等［3］報(bào)道了棘胸蛙爛皮病病原奇異變形桿菌（Proteusmirabilis），宋婷婷等［4］報(bào)道了棘胸蛙體表發(fā)白、肝臟發(fā)黑囊腫的一種新型疾病的病原為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。棘胸蛙白內(nèi)障病癥近年來呈現(xiàn)多發(fā)性態(tài)勢，發(fā)病率高，危害大，亟需開展相關(guān)的病原研究。為了達(dá)到控制該病的目的，我們于2014—2015年進(jìn)行了棘胸蛙白內(nèi)障病的病原診斷鑒定及敏感藥物篩選，以期為該病的防治和診斷提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1致病菌分離

患白內(nèi)障棘胸蛙和健康棘胸蛙均取自浙江省麗水市遂昌縣棘胸蛙養(yǎng)殖場，患白內(nèi)障棘胸蛙體重為150～200 g每只，健康棘胸蛙平均體質(zhì)量為（100± 20）g。發(fā)病棘胸蛙無菌操作分別取病蛙的眼睛、肝臟等病變部位，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，于28℃下培養(yǎng)24 h，挑取占優(yōu)勢的菌落重復(fù)劃線分離，直至得到純種，然后將純化菌轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2人工感染試驗(yàn)

1.2.1菌液制備

將純培養(yǎng)細(xì)菌分別接種在普通營養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，置于振蕩頻率為200 r·s-1的搖床中振蕩培養(yǎng)18 h，用滅菌生理鹽水采用比濁管法稀釋，配置成5×108m L-1濃度的菌液，置4℃環(huán)境中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人工感染

采用肌肉注射的方式感染健康棘胸蛙。將制備的菌液按每只0.2 mL劑量分別注射健康棘胸蛙，每組10只；設(shè)等量的生理鹽水為對照，注射劑量為每只0.2 m L。放養(yǎng)在經(jīng)消毒的水族箱中飼養(yǎng)觀察，觀察期為15 d。

1.3生理生化特性鑒定

對分離的致病菌進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化試驗(yàn)，鑒定方法參照有關(guān)文獻(xiàn)［5］所述方法進(jìn)行。

1.416S rDNA鑒定

采用TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒提取菌株的基因組DNA，設(shè)計(jì)通用引物（正向引物5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，反向引物5＇-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增的細(xì)菌16S rDNA產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.5藥物敏感試驗(yàn)

藥物敏感試驗(yàn)采用藥敏紙片法。將分離致病菌株于28℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋菌液至1×106m L-1，取200μL菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，稍干后取藥敏紙片均勻貼片于培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)18 h后測量抑菌圈大小。根據(jù)藥敏紙片標(biāo)準(zhǔn)確定敏感性。

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離

從發(fā)病的棘胸蛙眼睛和肝臟部位分離到BN1306、BN1307細(xì)菌。

2.2致病菌感染

將分離的2株細(xì)菌經(jīng)肌肉注射健康棘胸蛙。結(jié)果顯示，BN1306菌株注射棘胸蛙體內(nèi)，棘胸蛙一周內(nèi)死亡率為80%，癥狀表現(xiàn)為蛙眼球晶體皮質(zhì)渾濁，眼球凸出，眼瞼灰白，與自然發(fā)病基本相同（圖1）；BN1307菌株和對照組無感染發(fā)病現(xiàn)象，表明BN1306菌株為棘胸蛙白內(nèi)障的致病病原，且對棘胸蛙有較強(qiáng)的致病性。其感染結(jié)果如表1所示。

圖1　病變棘胸蛙眼球特征

表1　分離菌對棘胸蛙的人工感染結(jié)果

2.3病原鑒定

2.3.1致病菌形態(tài)及生理生化鑒定

BN1306菌為革蘭氏陰性短桿菌，無鞭毛，無莢膜和芽孢，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中觀察，菌落光滑半透明，邊緣整齊，中間略隆起，菌落可隨時(shí)間的延長而增大。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》鑒定，BN1306菌為布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）。

表2　細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

2.3.216S rDNA測序鑒定

對BN1306細(xì)菌利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。測得16S rDNA序列為1 401 bp（圖2）。

通過NCBI網(wǎng)站，對BN1306菌的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中各種菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對，與其相似性最高的前9個(gè)菌株見表3。通過16S rDNA序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)BN1306菌株所得結(jié)果與GenBank上收錄的布氏檸檬酸桿菌（Citrobacter braakii）同源性達(dá)到99%，因此可進(jìn)一步確認(rèn)引起該病的病原菌為布氏檸檬酸桿菌。

表3　菌株16S rDNA序列同GeneBank中細(xì)菌菌株同源性比較

2.4藥敏情況

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。布氏檸檬酸桿菌對諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、吡哌酸高度敏感，對氟哌酸、頭孢哌酮、慶大霉素、青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素和紅霉素不敏感。

圖2　細(xì)菌16S rDNA測序結(jié)果

表4　分離菌對抗菌藥敏感性

3　討論

布氏檸檬酸桿菌，也稱布氏枸櫞酸桿菌，是腸桿菌科檸檬酸桿菌屬成員。作為條件致病菌，主要在人和動物體內(nèi)分離到，可以引起動物黏膜發(fā)生炎癥、潰瘍［6］。布氏檸檬酸桿菌在水生動物方面也有引起中華鱉口咽腔潰爛綜合癥的報(bào)道［7］，但該菌引起棘胸蛙白內(nèi)障則首次報(bào)道。

由于蛙類的白內(nèi)障是以病癥特征來命名，因此，關(guān)于蛙類的白內(nèi)障是否是一個(gè)單獨(dú)的疾病種類，還是其他疾病所表現(xiàn)出的癥狀，仍有一些爭議，如牛蛙的腦膜炎膿毒性黃桿菌引起的歪頭腦膜炎病也有白內(nèi)障的癥狀［8］。目前在報(bào)道牛蛙白內(nèi)障病的病原和癥狀上有些不同，陳曉鳳等［9］認(rèn)為是由醋酸鈣不動桿菌（Acinetohacter calcoaceticus）引起的牛蛙白內(nèi)障病，肝臟紫黑色有腫大或紫紅色稍腫大，雙腿肌肉呈黃綠色；紀(jì)榮興等［10］報(bào)道認(rèn)為，引起牛蛙白內(nèi)障病原為嗜水氣單胞菌，患病牛蛙肝臟顏色變淡、微腫大，雙腿肌肉紅色，伴有紅腿癥狀等。因此，棘胸蛙的白內(nèi)障疾病是否還有其他病原，以及布氏檸檬酸桿菌引起的病理過程仍需進(jìn)一步研究。

藥敏實(shí)驗(yàn)表明，諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、吡哌酸等抗菌藥物對布氏檸檬酸桿菌有較好的抗菌作用，在實(shí)際防治過程中，在飼料中添加敏感藥物20 mg·kg-1劑量的諾氟沙星和40 mg·kg-1保肝藥物肝腎康拌食投喂，連用5 d，同時(shí)用0.5 mg· L-1二氧化氯對水體進(jìn)行消毒，起到良好的治療效果。由于棘胸蛙白內(nèi)障的病因和病理復(fù)雜，發(fā)病嚴(yán)

重的病蛙已幾乎不攝食，關(guān)鍵還是防重于治。養(yǎng)殖場應(yīng)加強(qiáng)棘胸蛙飼養(yǎng)管理，加強(qiáng)疾病預(yù)防，嚴(yán)格保證水體的流動更新，加強(qiáng)水質(zhì)的消毒工作，降溫保潔，放養(yǎng)密度要適當(dāng)，切勿放養(yǎng)過密。這對于預(yù)防該病的發(fā)生或者大面積蔓延具有切實(shí)有效的作用。

［1］ YE S，HUANG H，ZHENG R，et al.Phy1ogeographic analyses strong1y suggest cryptic speciation in the giant spiny frog（Dicrog1ossidae：Paa spinosa）and interspecies hybridization in Paa［J］.Plos One，2013，8（7）：e70403.

［2］ 蘇雪紅，張正江，紀(jì)任宗，等.棘胸蛙病害調(diào)查及藥敏試驗(yàn)初報(bào)［J］.福建水產(chǎn)，2001，3（1）：32-37.

［3］ 王瑞君，熊筱娟.棘胸蛙爛皮病奇異變形桿菌的分離、鑒定及對藥物敏感性研究［J］.淡水漁業(yè)，2012，42（4）：36-37.

［4］ 宋婷婷，鄭榮泉，張俊美，等.一種棘胸蛙新類型疾病病原分析［J］.福建水產(chǎn)，2014，36（5）：344-350.

［5］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［6］ 周昱，陳瓊，孔繁德，等.PCR快速檢測布氏枸櫞酸桿菌方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（3）：42-48.

［7］ 李本旺，李春枝，張邦杰，等.中華鱉口咽腔潰爛綜合癥病原的研究［J］.水產(chǎn)科技情報(bào)，2000，27（5）：210-213.

［8］ 葉雪平，楊廣智，羅毅志.牛蛙腦膜炎（歪脖子病）病原分離及防治技術(shù)研究［J］.浙江水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996，15（4）：301-304.

［9］ 陳曉鳳，陳祈輝，夏梅珠.牛蛙“白內(nèi)障”病病原及防治的研究［J］.福建水產(chǎn)，1995（2）：13-18.

［10］ 紀(jì)榮興，鄒文政，莫英軍.牛蛙“白內(nèi)障”病病原的初步研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，8（1）：8-11.

（責(zé)任編輯：萬 晶）

S 947.2

B

0528-9017（2016）07-1141-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160758

2015-12-12

國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014GB2C200199）；國家自然基金項(xiàng)目（31472015；31172116）；浙江省水產(chǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2012R10026-07）

程曉云（1975—），女，浙江遂昌人，工程師，從事森林資源管理與研究工作，E-mai1：chengxiaoyun@163.com。

鄭善堅(jiān)（1971—），男，副教授，從事水生動物疾病學(xué)研究工作，E-mai1：zhengsj@zjnu.cn。