Bt Cry1類毒素共性結構域的分析、表達及鑒定

劉貝貝，張 霄，謝雅晶，焦凌霞，劉 媛，張存政，趙巖巖，武愛華，劉賢金

（1南京農業大學植物保護學院，南京 210095；2江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/農業部農產品量安全控制技術與標準重點實驗室，南京 210014；3河南科技學院食品學院，河南新鄉 453003）

Bt Cry1類毒素共性結構域的分析、表達及鑒定

劉貝貝1，2，張 霄2，謝雅晶2，焦凌霞3，劉 媛1，2，張存政2，趙巖巖2，武愛華2，劉賢金1，2

（1南京農業大學植物保護學院，南京 210095；2江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/農業部農產品量安全控制技術與標準重點實驗室，南京 210014；3河南科技學院食品學院，河南新鄉 453003）

【目的】分析定位Bt Cry1類毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性結構域，克隆并表達共性結構域蛋白，為篩選Bt毒素廣譜抗體及建立廣譜檢測方法打下基礎。【方法】利用生物信息學和分子模擬技術，通過SWISS-MODEL同源建模分別對5種Cry1類毒素進行三維建模，并結合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法評價模型構象的合理性。通過分析比對5種Cry1類毒素的三維結構，確定Domain I 區域作為5種Cry1毒素的共性結構域。以含Cry1Ac基因的蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種為模板設計引物，PCR擴增獲得共性結構域Domain I基因，將其經Nco I和Not I雙酶切連接至原核表達載體pET-26b（+），構建原核表達載體pET-26b-Domain I。重組質粒經菌液PCR、雙酶切以及測序鑒定驗證正確后，轉化至E.coli BL21 （DE3），經終濃度為1 mmol·L-1的IPTG在20℃下誘導表達16 h后檢測共性結構域蛋白的表達情況。離心收集誘導表達的大腸桿菌菌液，進行超聲波破碎處理，收集上清及沉淀，采用 SDS-PAGE 分析融合蛋白的表達。利用His-Trap HP鎳親和柱純化上清中的可溶性融合蛋白，經SDS-PAGE電泳、Western blot和ELISA試驗驗證純化的共性結構域蛋白的生物活性。【結果】基于氨基酸序列及三維空間比對分析，發現 5種 Cry1類毒素的Domain I 的序列一致性最高，而且它們的DomainⅠ三維結構幾乎完全重合，確定Domain I 區域作為5種Cry1毒素的共性結構域；通過PCR、雙酶切及測序鑒定成功構建原核表達載體pET-26b-Domain I，經IPTG誘導表達、His-Trap HP鎳親和柱純化獲得了可溶性的Domain I共性結構域蛋白；SDS-PAGE和Western blot證實表達的共性結構域蛋白的分子量約為33.4 kD，且能與抗His標簽鼠單克隆抗體發生特異性反應；ELISA試驗證實共性結構域蛋白與5種Cry1類毒素特異性抗體均具有很強的結合能力，抗原表位分析結果顯示共性結構域蛋白具有和完整的 Cry蛋白存在多個潛在抗原表位位點的特征，抗原表位區域所占的比例分別為 48.4%和63.6%，表明共性結構域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應性。【結論】基于分子模擬與分子克隆技術，成功定位及表達純化獲得共性結構域蛋白，為下一步利用共性結構域為靶標分子制備廣譜特異性識別Cry1類毒素抗體打下基礎。

Bt Cry1類毒素；共性結構域；原核表達；純化

0　引言

【研究意義】隨著轉Bt Cry基因在抗蟲性作物中大面積的推廣及應用，在給人類帶來極其顯著的經濟、社會和生態效益的同時，其應用存在的生態安全風險以及對人類和其他非靶標生物的安全隱患也備受關注［1-3］，越來越多的國家針對轉基因產品建立了標識系統［4］，因此對 Cry毒素表達產物安全篩查檢測就尤顯迫切。目前報道對轉基因產品中毒素蛋白的檢測方法和市場應用的ELISA試劑盒主要是單一毒素的抗體檢測［5-7］，而且不同的毒素需要制備相應抗體，周期長、成本高，難以滿足實際應用時一種抗體檢測多種毒素的需求。因此，憑借Bt Cry毒素三維結構具有較高相似性的特點，開發基于共性結構的Bt Cry毒素廣譜特異性檢測技術是一項非常有應用價值的工作。【前人研究進展】目前，針對小分子有害物質多殘留免疫分析技術主要利用小分子的共性結構作為半抗原制備廣譜特異性抗體用于檢測［8-10］。研究發現盡管Cry毒素的氨基酸序列相似性很低，但是它們的三維結構均非常相似，都是由3個結構域組成，且存在大量的保守區域［11］。趙新民等［12］在對Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa 和Cry4Aa 4類具有代表性毒素三維結構的預測和對比分析中發現它們的三級結構模型非常相似，其中DomainⅠ幾乎完全相同，結構的相似性高于其序列的相似性；吳洪福等［13］對已解析的Bt晶體蛋白的三維結構進行了比較分析，發現它們都有類似的結構，而且單獨比較各種Cry蛋白的DomainⅠ，發現它們的DomainⅠ差別最小。而針對多種Cry毒素的廣譜檢測目前還未見報道。目前，美國Envirologix 公司生產的Cry1Ab/Cry1Ac平板試劑盒，能夠同時檢測Cry1Ab/Cry1Ac兩種毒素［6，14］，這是基于它們的三維結構具有高度相似性的特點，也為后續研究提供了依據。【本研究切入點】基于Cry毒素具有共性結構域，以及抗體對共性結構域存在很強的交叉反應［15-17］，分析定位Cry1類毒素的共性結構域，通過對其成功表達及生物活性驗證，制備廣譜識別Cry1類毒素的抗體，應用于Cry毒素的廣譜檢測。【擬解決的關鍵問題】基于序列及空間比對分析，定位共性結構域；表達純化共性結構域蛋白，并驗證其生物活性，為下一步制備廣譜抗體打下基礎。

1　材料與方法

試驗于2014年5月至2015年11月在江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種（Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki 2671）為徐健博士提供（江蘇里下河地區農業科學研究所）；表達載體pET-26b（+）購于Novagen公司；E. coli Trans10、E. coli BL21（DE3）感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 試驗材料與試劑 引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；PCR產物回收試劑盒購自Promega公司；質粒提取試劑盒購自 Axygen公司；Taq DNA聚合酶、Nco I、Not I內切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；His-Trap HP純化柱購自GE Healthcare公司；其他試劑均為分析純級試劑。

1.2 方法

1.2.1 序列比對、同源建模及模型評價 從 NCBI數據庫檢索5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的氨基酸序列（登錄號分別為ALJ10947.1、KF148682.1、ABQ23438.1、BAM67040.1、ACD50893.1），進行多序列比對分析。然后分別以5 種 Cry1類毒素的 Domain I作為目標蛋白序列，用BLAST中的 blastp suite對 PDB蛋白結構數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分別進行多序列同源性搜索，取同源性最高的晶體結構作為同源建模的模板。其中 Cry1Ac已經獲得晶體結構模型［18-19］，無需建模。利用Swiss-Model（http：//swissmodel. expasy.org/）蛋白質結構同源建模服務器［20-21］，分別預測了4種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的 Domain I三維結構，模建結構采用PROCHECK［22］、ERRAT［23］以及Verify3D［24］進行評估，檢測其合理性。

1.2.2 共性結構域基因克隆 通過對5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）DomainⅠ的核苷酸序列及三維結構比對，以其中任意一種毒素的DomainⅠ擴增表達共性結構域，是可行的。因此以筆者實驗室現有的含 Cry1Ac的蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種為模板來設計其DomainⅠ引物。設計引物時在DomainⅠ氨基酸序列C端加長6個氨基酸，并插入限制性內切酶切位點，以方便后續試驗中原核表達載體的構建以及共性結構域蛋白表達、純化研究。上游引物為5′-CATGC/CATGGATAACAATCCGAA CAT-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點；下游引物為5′-ATAAGAATG/CGGCCGCGGATCCTCGAATTGG ATATCTTC-3′，下劃線部分為NotⅠ酶切位點。PCR反應條件為95℃預變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環；最后72℃終延伸10 min，4℃保存。擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗證后，PCR產物回收試劑盒回收、純化目的片段。

1.2.3 pET-26b-DomainⅠ重組質粒的構建 DomainⅠ基因PCR回收、純化產物和表達載體pET-26b同時進行NcoⅠ和NotⅠ雙酶切處理，純化回收后，T4 DNA連接酶連接過夜，連接產物轉化E. coli Trans10感受態細胞。轉化的菌液涂布于 LB-Kan（含 50 μg·mL-1Kanamycin）平板上，挑取陽性轉化子培養后提取質粒，對質粒進行酶切、PCR擴增鑒定及序列測定（由上海生物工程公司完成）。將測序結果提交到GenBank進行序列同源性比對。

1.2.4 DomainⅠ共性結構域的原核表達及純化 通過測序及雙酶切驗證后，將pET-26b-DomainⅠ重組質粒轉化至E. coli BL21（DE3），篩選陽性菌株。挑取陽性克隆，接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養基中過夜培養，次日按 1%比例轉接于含 50 μg·mL-1Kanamycin的LB液體培養基中，37℃，250 r/min振蕩培養至 OD600約為 0.6—0.8，加入終濃度為 1 mmol·L-1IPTG，20℃誘導表達16 h，以空載菌株為對照。4℃ 10 000×g離心15 min，收集菌體稱量濕重，以100 mg·mL-1比例用磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）重懸菌體，加入溶菌酶（終濃度1 mg·mL-1），PMSF（100 mmol·L-1）混勻后，于冰浴中超聲破碎菌體，12 000 ×g離心收集上清液，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況。

將收集的 DomainⅠ上清液上樣于經 Binding Buffer A（20 mmol·L-1磷酸鹽，500 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1咪唑，pH 7.4）預平衡的HisTrap HP 1 mL預裝柱中，反復上樣，用5—10倍柱體積Binding Buffer A洗去未與柱子結合的蛋白，再用分別含20、50、100、200、300、400、500 mmol·L-1咪唑的Elution Buffer B（其他成分同Binding Buffer A）洗滌柱子，收集各個梯度的洗脫液，SDS-PAGE分析蛋白純化效果。

1.2.5 Western blot和ELISA試驗鑒定 純化的共性結構域蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，用濕轉法將目的蛋白轉移至PVDF膜上，5% MPBS（含5%脫脂奶粉的PBS）室溫封閉過夜，洗膜后，加入HRP標記的抗His標簽鼠單克隆抗體（1∶5 000）作為二抗，室溫孵育2 h，洗膜后用DAB底物顯色試劑盒顯色，至目的條帶清晰終止反應。

分別取100 μL 4 μg·mL-1的純化的共性結構域蛋白和5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的標準蛋白包被于96孔酶標板上，同時設置陰性對照組，4℃包被過夜。次日用洗滌緩沖液PBST（含0.05% Tween 20的PBS）洗板3次，每次3 min。每孔加入200 μL 3% MPBS封閉，37℃孵育2 h后洗滌，然后每孔分別對應加入100 μL 1∶1 000稀釋的純化的抗Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F多克隆抗體，37℃孵育2 h后洗滌，再加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。PBST洗滌4—5次后加TMB顯色15 min，每孔加50 μL的2 mol·L-1H2SO4終止反應后于450 nm 測OD值。

2　結果

2.1 序列比對、同源建模及模型評價

5種 Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的3個結構域的氨基酸序列比對如圖1-A，可以看出Domain I 的序列一致性最高達到71%。分別以Cry1Ab、Cry1B、Cry1C和Cry1F的DomainⅠ為目標蛋白序列，對PDB蛋白結構數據庫分別進行序列同源性搜索，結果顯示Cry1Ab、Cry1C和Cry1F 的 Domain I同源性最高的模版均是Cry1Ac（PDB編號為4arx.A），而Cry1B的 Domain I選定的模板為Cry3Bb1（PDB編號為1ji6.A）。

經Swiss-Model構建的4種毒素Domain I三維結構模型，通過Ramachandran plot（圖1-B）、ERRAT 和Verify3D（表1）評價構象合理性，從結果可以看出所構建的4種DomainⅠ結構模型是合理可信的，可以用于后續研究。對5種Cry1類毒素的DomainⅠ三維結構模型進行重合比對（圖 1-C），發現它們的三維結構幾乎完全重合，因此以任意的DomainⅠ擴增表達共性結構域是可行的。

2.2 共性結構域基因的克隆與序列分析

圖1　5種Cry1類毒素氨基酸序列多重比對（A）、三維模型的拉氏圖分析（B）及三維結構比對（C）Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences （A）， Ranmachandan plot （B） and comparison of the tertiary structures （C） of five toxins

以徐健博士提供的 Bt菌株提取的質粒為模板，PCR擴增獲得了大小約為 800 bp的擴增條帶（圖2-A）。擴增出的條帶與預期大小一致。然后將純化后的PCR產物連接至pET-26b載體中并進行測序，序列分析結果表明，該基因編碼區序列為880 bp，編碼293個氨基酸。經NCBI網站Blastp搜索比對后發現與Cry1Ac Domain I序列一致性為100%，序列比對得到蛋白的系統進化樹（圖2-B）。

表1　模型評價Table 1 Evaluation of model structures

圖2　DomainⅠ基因的PCR擴增（A）及其序列同源性分析（B）Fig. 2 PCR amplification （A） and sequence homologous analysis （B） of DomainⅠ

2.3 pET-26b-DomainⅠ表達載體的構建及鑒定

通過 pET-26b-DomainⅠ化轉至 E. coli BL21 （DE3）以后，挑取陽性單菌落進一步PCR擴增、酶切鑒定。PCR電泳結果（圖3-A）顯示，陽性菌落擴增片段大小與預計大小（約1 039 bp）一致。提取陽性菌落的重組質粒，經NcoⅠ和NotⅠ酶切得到800 bp左右的目的片段（圖3-B），說明DomainⅠ的表達載體pET-26b-DomainⅠ構建成功。

2.4 共性結構域蛋白的表達與純化

通過測序及雙酶切驗證后，將陽性克隆在20℃培養 16 h條件下表達，離心分別收集上清和菌體，加PBS重懸菌體后冰上超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀。經SDS-PAGE電泳發現，破碎上清在33.4 kD處出現明顯的特異性蛋白條帶，與理論分子量大小一致（圖4-A）。將誘導的Domain I上清經HisTrap HP預裝柱梯度洗脫純化后，進行SDS-PAGE分析，結果見圖4-B，經梯度洗脫后，最終Domain I（約33.4 kD）在咪唑濃度為300 mmol·L-1時被洗脫下來，純化的目的蛋白條帶單一。

2.5 Western blot、ELISA和抗原性分析

Western blot結果證實，純化的 Domain I（含6×His標簽）對抗His標簽鼠單克隆抗體有免疫反應，且蛋白分子量大小在33.4 kD左右，同預期結果一致（圖5-A）。ELISA結果發現純化的Domain I分別與5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）特異性抗體均具有很強的結合能力（圖5-B）。通過Jameson-Wolf法分別預測Cry1Ac和DomainⅠ氨基酸的抗原性指數（圖5-C），結果顯示DomainⅠ蛋白和 Cry1Ac蛋白均存在多個潛在的抗原表位位點，抗原表位區域所占的比例分別為48.4%和63.6%。說明Domain I區域存在較強的免疫原性，能夠在在免疫過程中產生針對Domain I的特異性抗體。

圖3　pET-26b-Domain I 重組質粒菌液PCR（A）及雙酶切（B）驗證Fig. 3 PCR amplification （A） and restricted enzymes digestion （B） of pET-26b-Domain I plasmid

圖4　共性結構域蛋白表達與純化的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the common structural domain expression and purification

3　討論

本研究對5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的氨基酸全序列進行了比對，發現它們的 DomainⅠ序列 Identity最高。利用Swiss-Model對DomainⅠ進行同源建模分析，發現5種毒素的DomainⅠ三維結構幾乎完全重合。趙新民等［12］對Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa和Cry4Aa 4類具有代表性的毒素結構進行了系統比較，發現它們的三級結構模型非常相似，而且所有的3個結構域中結構域I中的 α螺旋幾乎完全重疊，結構差異最小，只有結構域 II、III有細微差別；吳洪福等［13］對已解析的 Bt晶體蛋白的三維結構進行了比較分析，發現它們都有類似的結構，而且單獨比較各種Cry蛋白的結構域Ⅰ，發現它們的結構域Ⅰ差別最小。本研究結果與前人的研究結論完全一致，這也是筆者選取DomainⅠ作為共性結構域的依據。

圖5　共性結構域蛋白的Western blot（A）、ELISA（B）和抗原性（C）分析Fig. 5 Western blot （A）， ELISA （B） and antigenicity （C） analysis of the common structural domain protein

目前，關于DomainⅠ單獨表達純化也有文獻報道［25］，本文在前人研究的基礎上對共性結構域DomainⅠ進行表達，但前期純化及 ELISA、Western blot驗證均沒有結果，分析原因可能是目的蛋白在折疊時由于空間位阻使His標簽沒有充分暴露。根據融合蛋白連接肽的設計原則［26-27］，筆者對DomainⅠ蛋白與His標簽蛋白之間的連接肽長度進行適當優化，使其在優化前的5個氨基酸基礎之上增加至11個氨基酸，使目的蛋白在正常折疊的同時，His標簽也能充分暴露在其C端，最終純化得到共性結構域蛋白。

抗原表位是蛋白質抗原性的基礎，在蛋白質二級結構分析中，α螺旋、β折疊的結構規則不易形變，多位于蛋白質內部形成構象表位，不易與配體結合，一般不作為抗原表位，而β轉角結構和無規則卷曲比較松散，易形成線性表位，有利于抗體結合，符合作為抗原表位的特性［28-29］。本研究中的共性結構域蛋白主要是一個由7個α螺旋組成的螺旋束，但從其三維結構觀察發現也具有作為連接鏈的無規則卷曲（圖1-C），通過ELISA試驗也證明它具有與抗Cry毒素抗體特異結合的能力，說明其共性結構域蛋白中存在的無規則卷曲可以形成抗原表位，使其具有免疫原性和免疫反應性。此研究結果為下一步利用共性結構域蛋白制備其單、多克隆抗體或者通過時菌體展示技術制備廣譜抗體進行多種Cry毒素篩選提供理論基礎。

4　結論

分析并定位了共性結構域，克隆、表達及純化共性結構域蛋白；證實DomainⅠ區域存在抗原表位并具有很強的免疫原性及反應性；經Western blot和ELISA鑒定了共性結構域蛋白的生物活性。試驗結果可為Cry1類毒素共性結構域廣譜抗體的制備及建立多種Cry毒素廣譜篩選提供理論依據及技術指導。

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（責任編輯 岳梅）

Analysis， Expression and Identification of the Common Structural Domain of Bacillus thuringiensis （Bt） Cry1 Toxins

LIU Bei-bei1，2， ZHANG Xiao2， XIE Ya-jing2， JIAO Ling-xia3， LIU Yuan1，2， ZHANG Cun-zheng2，ZHAO Yan-yan2， WU Ai-hua2， LIU Xian-jin1，2
（1College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095；2Institute of Food Quality Safety and Detection Research， Jiangsu Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Food Quality and Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base/Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality， Ministry of Agriculture，
Nanjing 210014；3School of Food Science， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan）

【Objective】The objective of this study is to express the optimal common structural domain through analyzing and locating the common structure of five Bacillus thuringiensis Cry1 toxins. This research will lay a foundation for producing the generic antibody and developing the detection method for Cry1 toxins. 【Method】Through bioinformatics， molecular simulation technique and homology modeling to build the three-dimensional structure models of five Cry1 toxins. The structures were evaluated using three programmes， Ramchandran plot， Verify3D and ERRAT. Domain I was identified as the common structure domain of five Cry1 toxins finally. In order to construct the pET-26b-Domain I vector， primers were designed according to the Cry1Ac gene of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki. As well as insert with Nco I and Not I digestion sites. When it was identified by PCR， restriction enzyme digestion and sequencing， the recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 （DE3） which was induced with 1 mmol·L-1IPTG， 20for 16 h. The supernatant and precipitate were collected and verified by SDS-PAGE after E. coli BL21 （DE3）cells were collected and crushed by ultrasonic wave. The soluble fusion protein was purified by His-Trap HP nickel affinity column and verified by SDS-PAGE， Western blot and ELISA. 【Result】 According to the analysis of amino acid sequences and threedimensional structures of the five Cry1 toxins， the sequences of Domain I were the highest identity part and its three-dimensional structure was very similar and then the Domain I was chosen as the common structure domain of the five Cry1 toxins. The expression vector pET-26b-Domain I was constructed successfully， and soluble Domain I protein was expressed and purified. The molecular weight of the fusion protein was confirmed to be 33.4 kD by SDS-PAGE and Western blot， which also showed specific activity to anti-6×His monoclonal antibody. The ELISA assay showed that the Domain I protein had a good sensitivity with the specific antibodies of the five Cry1 toxins， and the epitope prediction results showed that both the Domain I protein and the complete Cry protein existed multiple potential epitopes， and the percentage of their antigenic peptides were 48.4% and 63.6%， respectively. These results indicate that the Domain I protein has good immunogenicity and immune response. 【Conclusion】Based on molecular simulation and molecular cloning technology， the conserved structural domain protein was successfully expressed and purified. This study has established a foundation for the following studies and the common structural domain protein would as target molecule for the production of the generic antibody of Cry1 toxins in further research.

Bacillus thuringiensis Cry1 toxins； common structural domain； prokaryotic expression； purification

2016-03-18；接受日期：2016-04-25

國家自然科學基金（31371778、31301703）、國家公益性行業（農業）科研專項（201303088）、江蘇省自主創新項目（CX（14）5068）

聯系方式：劉貝貝，E-mail：2013102120@njau.edu.cn。通信作者劉賢金，E-mail：jaasliu@jaas.ac.cn