中國3個主栽煙草品種的差異蛋白質組學研究

徐 瑩，晏國全，張 揚，余紅秀

（復旦大學生物醫學研究院，上海 200032）

中國3個主栽煙草品種的差異蛋白質組學研究

徐 瑩，晏國全，張 揚，余紅秀

（復旦大學生物醫學研究院，上海 200032）

【目的】從全蛋白質組學水平研究煙草，篩選具有重要特性的蛋白質，闡明其相關代謝通路，使得煙草的基礎科學研究和品種培育工作有所突破。【方法】利用苯酚法提取中國 3個主栽煙草品種紅花大金元、K326和云煙87葉片的蛋白質，酶解后采用串聯質量標簽技術（tandem mass tag，TMT）標記，結合二維液相色譜串聯質譜技術（2D LC-MS/MS）對3個煙草品種葉片的蛋白質組成進行分析，運用Proteome Discoverer軟件提取譜圖后在 MASCOT 搜索引擎上鑒定蛋白質和肽段，并對鑒定的蛋白質進行系統的生物信息學分析，包括數據相關性分析、分層聚類分析和主成分分析，同時按照2倍上下調的原則采用火山圖篩選不同品種煙草中表達差異顯著的蛋白質，最后利用 KEGG通路分析煙草中重要蛋白質的分布及功能。【結果】鑒定紅花大金元、K326和云煙 87煙草樣品的蛋白質Group總數為3 079，蛋白質ID數為10 343。從分層聚類分析和主成分分析中蛋白質的整體表達情況可見，K326和云煙87蛋白質表達情況較相似，而紅花大金元與前兩者相差較大。后續的差異蛋白質篩選也驗證了該結果，表現為云煙87和K326之間僅存在29個差異表達的蛋白質，其中13個蛋白質覆蓋8條代謝通路，包括類黃酮生物合成，參與類黃酮合成路徑的查爾酮合成酶在K326中的相對含量顯著高于云煙87。紅花大金元和云煙87之間有160個蛋白質差異表達，其中103個蛋白質覆蓋42條代謝通路，包括谷胱甘肽代謝，相對定量結果顯示谷胱甘肽代謝途徑相關的3種酶，谷胱甘肽過氧化物酶、磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽S-轉移酶在紅花大金元中的含量均顯著低于云煙87。紅花大金元和K326之間存在119個差異蛋白質，其中89個蛋白質覆蓋41條代謝通路，包括外源物質細胞色素P450代謝。篩選獲得的重要差異蛋白質的相對定量結果顯示一些與抗性相關的蛋白質，如蛋白酶抑制劑，在云煙87中的表達量遠低于K326和紅花大金元，同時結果表明紅花大金元中的超氧化物歧化酶含量處于較低水平。【結論】TMT技術結合2D LC-MS/MS可對不同品種煙草的葉片蛋白質進行有效地分離和鑒定，鑒定出的蛋白質大部分是參與光合作用、物質代謝或者與抗逆性相關。

煙草；差異蛋白質組學；串聯質量標簽；二維液相色譜串聯質譜

0　引言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacum），作為中國重要的經濟作物［1］，實現其質量、抗性等的精確改良和定向育種具有重要意義。隨著煙草基因組學的蓬勃發展，日漸發現，僅僅探討基因是遠遠不夠的，蛋白質作為基因功能的直接體現者和最終執行者，是生物生命活動的基礎［2-3］。因此，只有結合煙草基因的表達產物——蛋白質展開深入研究，才能破譯其基因組序列中蘊藏的遺傳信息，從而揭示煙草生命活動的本質［4］以突破傳統育種的技術瓶頸。【前人研究進展】早前關于煙草蛋白質定性定量的研究，均基于二維凝膠電泳（2DE）分離結合基質輔助激光解吸附飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）鑒定的技術，如GHARECHAHI等［5］利用高分辨率二維凝膠電泳檢測到930個蛋白點，但由于2DE在技術上存在一些挑戰，導致多種可能具有重要功能的痕量調控蛋白難以被分離［6-8］。因此，更先進、更高通量、準確性和靈敏度的技術用于煙草蛋白質組學定性定量的研究顯得尤為重要。隨著蛋白質組學實驗技術的日漸發展，二維凝膠電泳技術被取代，標記技術的發明極大地加速了蛋白質組學向更廣和更深的領域發展。蔡永占等［9］報道利用 iTRAQ標記技術開展不同氣候條件下云煙87葉片差異表達蛋白分析，最終注釋到47個差異表達蛋白質，并分析得出這些蛋白質參與碳代謝、氮代謝和環境響應等生命進程。蔡永占等［10］在2個生態點的煙草葉片中檢測到39個差異蛋白點。張柳等［1，11］采用iTRAQ標記方法共檢測到煙草不同發育階段432個差異表達蛋白質，其中注釋到308個蛋白質與多種生命過程相關。【本研究切入點】以上研究均是有關不同外界環境或者不同發育階段煙草的差異蛋白質組學，而利用標記技術開展關于不同煙草品種間差異蛋白質組學的研究卻鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以3個煙草品種紅花大金元、K326和云煙87的葉片為研究材料，采用串聯質量標簽技術（tandem mass tags，TMT）結合液質聯用技術，對不同品種煙草的蛋白表達進行比較研究，旨在分析不同煙草品種在蛋白質組學水平上存在的差異，為未來研究和發展煙草生理學奠定堅實的基礎，也進一步為煙草品種的改良提供理論依據。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

紅花大金元、K326和云煙87均為中國主栽煙草品種，三者各具特色。紅花大金元，因其突出的、無法替代的香型特點而受到各卷煙企業的青睞［12-13］，但其易烤性差，高感黑脛病［14-15］；云煙 87是由云煙 2號和K326雜交選育而成，綜合了雙親的優點［16］，K326和云煙 87均易烘烤，中抗黑脛病［15］。煙草品種紅花大金元、K326和云煙87的中部葉片，來自湖北中煙工業有限責任公司，種植于湖北恩施州沐撫基地，屬中亞熱帶季風型山地濕潤性氣候，按照行距120 cm，株距55 cm，采用統一的大田管理措施。移栽后70 d（成熟前期），每個品種隨機采集 9株煙草上 9—11葉位的中部葉片，重復采樣2次，于4℃冰箱保存備用。

1.2 蛋白質樣品的制備

每個煙草品種每份稱取1 g葉片，液氮冷凍條件下，在預先冷卻的研缽中將材料研磨成細碎的粉末。

1.3 蛋白質提取

林世鋒等［17］通過比較 4種總蛋白的提取方法證明苯酚法提取分離得到的蛋白數量較多，雜質較少，分離效果較好，更適合后續分析。因此，利用苯酚法［18］進行葉片全蛋白提取。在離心管中加入3 mL提取緩沖液（500 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液、500 mmol·L-1EDTA溶液、700 mmol·L-1蔗糖溶液、100 mmol·L-1KCl溶液，用HCl溶液調pH至8.0，使用前加入β-巰基乙醇和苯甲基磺酰氟，最終濃度分別為2%和1 mmol·L-1），并加入1 g研碎的煙草葉片，渦旋后在冰浴中振蕩10 min，再加入等體積的Tris飽和酚，室溫下振蕩10 min后將樣品離心（10 min、5 500 r/min、4℃），分層后最上層的苯酚轉移至新的離心管中。在含蛋白質的苯酚液中加入3 mL的提取緩沖液進行反萃取，振蕩3 min后渦旋；樣品離心（10 min、5 500 r/min、4℃）后轉移上層酚相至新離心管中，并加入4倍體積的沉淀液（預冷的0.1 mmol·L-1乙酸銨甲醇溶液）。顛倒振蕩離心管，-20℃沉淀過夜。離心沉淀蛋白質（10 min、5 500 r/min、4℃）。離心后，用預冷沉淀液漂洗沉淀3次，最后用預冷丙酮漂洗。每一次漂洗后，樣品均要離心（5 min、5 500 r/min、4℃）。真空干燥沉淀，-80℃貯藏充分干燥的蛋白質沉淀。

1.4 蛋白定量

根據 BRADFORD［19］的方法測定提取后的樣品蛋白質濃度，以牛血清蛋白（BSA）作為蛋白標準品，作標準曲線，在λ=595 nm時，應用UV mini 1240紫外分光光度計測定出每個蛋白質樣品在595 nm波長下的OD值，通過標準曲線方程計算相應蛋白質樣品的濃度，剩余樣品分裝于-80℃冰箱冷藏備用。

1.5 酶解與標記

對提取的蛋白質樣品進行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便于蛋白質樣品變性并利用蛋白酶進行水解。按照 1∶30比例在蛋白質樣品中加入胰蛋白酶，37℃的條件下酶解16 h；TMT標記試劑平衡至室溫，每管標記試劑中加入41 μL乙腈，渦旋1 min，離心甩至管底，將標記試劑分別加入對應肽段溶液中，不同樣品用不同的同位素標記。126標記云煙蛋白質樣品1（Y1），127標記云煙蛋白質樣品2（Y2），128標記紅花大金元蛋白質樣品1（H1），129標記紅花大金元蛋白質樣品2（H2），130標記K326蛋白質樣品1（K1），131標記K326蛋白質樣品2（K2）。肽段與標記試劑混勻后，甩至管底，室溫靜置2 h，加入8 μL 5%羥胺，室溫靜置15 min以終止反應。將標記好的多個樣品混合成一個樣品，轉移至新的離心管中。對真空抽干標記后的樣品進行液相串聯質譜分析。

1.6 液質聯用

色譜條件：采用 Waters納升級超高效液相色譜（UPLC?）系統。

第一維色譜條件：高pH流動相A為20 mmol·L-1甲酸銨，pH=10.0（色譜純氨水調節）；高pH流動相B為20 mmol·L-1甲酸銨，90%乙腈，pH=10.0（色譜純氨水調節）。使用52 μL A相溶解除鹽后的標記肽段粉末。在Waters公司H-Class超高壓液相色譜系統上使用超高效色譜柱（BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×50 mm）進行分離，上樣50 μL。流速600 μL·min-1，在紫外光波長為215 nm條件下檢測。從2 min開始，每0.5 min收集一管餾分。

第二維色譜Nano LC的洗脫條件及梯度：A液成分：水，0.1%甲酸，B液成分：乙腈，0.1%甲酸，色譜柱：類型C18，規格500 mm×75 μm，孔徑100 ?，粒徑2 μm，流速：300 nL·min-1，每個餾分溶解于32 μL A相中，上樣8 μL，每個餾分運行2 h液質聯用分析。

Q-Exactive質譜鑒定：將標記好的酶解產物經二維液相色譜分級分離并脫鹽后用 Q-Exactive 質譜儀進行質譜分析。檢測方式：離子化模式：正離子模式；離子源電壓：1 800 V，毛細管溫度：250℃；一級掃描范圍：350—1 200 Da；二級掃描范圍：依賴于一級母離子質荷比自動選擇；碎裂模式：高能碰撞解離（higher energy collision dissociation，HCD）。獲得差異表達肽段及其序列，并通過二級質譜中不同TMT的豐度及面積來計算不同樣品間差異蛋白質的相對含量。

1.7 蛋白鑒定及數據庫查詢

運用 Proteome Discoverer軟件提取譜圖后在MASCOT搜索引擎（Version 2.3）中進行蛋白質和肽段鑒定。查詢參數如下：數據庫和庫容：NCBI，104 349（茄科）。搜庫條件：固定修飾設定為半胱氨酸碘脲甲基化；可變修飾為甲硫氨酸氧化、賴氨酸 TMT標記、肽段N端TMT標記；一級搜庫誤差為10×10-6mol·L-1；二級搜庫誤差為 50 mmu；最大漏切位點設為2；采用胰酶；使用Percolator算法進行數據卡值保證假陽性率（false positive rate，FDR）小于等于1%。搜索結束后，Proteome Discoverer軟件根據Mascot搜索結果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析。

1.8 生物信息學分析

通過相關性分析、分層聚類分析（hierarchy clustering analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）從不同角度對所有鑒定的蛋白質數據進行質量檢測評估，并將定量數據按照2倍上下調的原則，利用火山圖篩選不同品種煙草的差異蛋白質［20］。最后，利用KEGG通路分析煙草目標蛋白的分布及功能［21］。

2　結果

2.1 蛋白鑒定結果

經質譜鑒定和數據庫查詢，鑒定紅花大金元、K326和云煙87煙草樣品的蛋白質Group數為3 079，蛋白質ID數為10 343。

2.2 相關性分析

相關性散點圖可通過散點圖和數據來衡量樣品間的相關性。從圖1可以看出，H1和H2的相關性系數為0.966，系數較高表示紅花大金元組內數據相關性較好。組間相關性系數低，線性差是可以接受的，說明不同煙葉品種間蛋白質表達譜差異較大。

圖1　3種煙草蛋白質組數據的相關性散點圖Fig. 1 Correlation scatter diagram of the protein data of three tobacco varieties

2.3 分層聚類分析

分層聚類分析是用3個煙草品種葉片蛋白質的表達值來重新排列蛋白，以識別其中最重要的差異蛋白質，具體是分配數據使其形成層層有嚴格等級的嵌套型子集，最終構成一個類似于家譜的樹狀結構［22］，從而顯示不同煙草品種具有代表性的差異表達蛋白群。通過對全部有定量信息的蛋白質進行分層聚類分析（圖 2），蛋白質被分成表達上調（紅色）、表達下調（綠色）和表達無差異（黑色）3種集群。組內樣本相似度較高，先被聚成同一個亞簇，由于K326和云煙87樣本蛋白質表達相似互相聚類，最終形成與紅花大金元樣本明顯不同的一簇。由此可見，K326和云煙87葉片蛋白質表達相似度高，蛋白質表達量的上調與下調較為一致，但二者的蛋白質表達與紅花大金元則存在較大差異。

圖2　3種煙草蛋白質組的分層聚類分析Fig. 2 Hierarchy clustering analysis for the proteome of three tobacco varieties

2.4 主成分分析

主成分分析是基于原有變量建立兩兩不相關的反映差異蛋白質組數據原有信息的新變量信息［23］，通過主成分分析構建了反映3個不同煙草品種差異蛋白質組信息的三維分析圖（圖 3），克服變量過多的復雜性，降低鑒定蛋白質的數據至低維度空間。直觀地顯示了樣本的蛋白質組差異，云煙87和紅花大金元的組內數據重復性較好，云煙87和紅花大金元在第一主成分（component 1）和第三主成分（component 3）上均存在較大差異，在第二主成分（component 2）上差別很小。

2.5 差異蛋白質篩選及KEGG通路分析

圖3　3種煙草蛋白質組的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis for the proteome of three tobacco varieties

通過控制2倍上下調來篩選品種間的差異蛋白質并進行KEGG通路分析（表1），K326和云煙87存在29個差異蛋白質（表1，圖4-A），其中13個蛋白質覆蓋8條代謝通路（表1），包括類黃酮生物合成（圖 5）、氨基酸代謝等，并比較得出參與類黃酮合成路徑的查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS，EC 2.3.1.74）在K326中的相對含量顯著高于云煙87（圖6）。紅花大金元和云煙87存在160個差異蛋白質（表1，圖4-B），其中103個蛋白質覆蓋42條代謝通路（表1），包括谷胱甘肽代謝（圖7）、TCA循環等，相對定量結果顯示谷胱甘肽代謝途徑中的谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GP，EC 1.11.1.9），磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPx，EC 1.11.1.12）和谷胱甘肽 S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST，EC 2.5.1.18）3種酶在紅花大金元中的含量均顯著低于云煙87（圖8）；K326和紅花大金元存在119個差異蛋白質（表1，圖4-C），其中89個蛋白質覆蓋41條代謝通路（表1），包括外源物質細胞色素P450代謝等。圖表中得出不同煙草品種間差異蛋白質的表達情況，也驗證了分層聚類分析得出的關于K326和云煙87葉片蛋白質表達相似度高而二者與紅花大金元存在較大差異的結果。

圖4　3種煙草差異蛋白質的火山圖Fig. 4 Volcano plot of the differentially expressed proteins of three tobacco varieties

圖5　類黃酮生物合成通路部分Fig. 5 Part of flavonoid biosynthesis pathway

表1　3種煙草差異表達蛋白的數目及其覆蓋的代謝通路Table 1 Number of differentially expressed proteins and metabolic pathways covered by proteins of three tobacco varieties

其中，對于差異尤為明顯的蛋白質進行相對定量分析（圖9），云煙87中蛋白酶抑制劑的表達量遠低于K326和紅花大金元（圖9-A），而在超氧化物歧化酶的含量方面則是紅花大金元處于劣勢（圖9-B）。

圖6　云煙87和K326中查爾酮合成酶相對含量的比較Fig. 6 Comparison of relative content of chalcone synthase between Yunyan87 and K326

3　討論

本研究運用串聯質量標簽技術，輔助液質聯用鑒定紅花大金元、K326和云煙87葉片的差異表達蛋白質，與XIE等［23］報道正常和受到鹽脅迫的煙草中共鑒定到5 570個蛋白質、GHARECHAHI等［5］利用高分辨率二維凝膠電泳檢測到煙草中930個蛋白點相比，本研究鑒定的蛋白質數量在目前已有報道的煙草蛋白質組學數據中屬于規模最大的。

3.1 類黃酮的合成路徑

云煙87和K326中存在的差異蛋白質參與圖5中的類黃酮合成途徑，途徑中的查爾酮合成酶被報道是類黃酮合成的第一個關鍵酶［24］。煙草中的類黃酮化合物被李勇等［25］報道是煙草香味的重要前體物質，其分解產物可提高煙草的香氣質量，改善煙草香味品質。表現為在煙葉生長、成熟、調制、醇化以及燃燒過程中轉化產生次級產物從而直接影響烤煙的香氣質和香氣量［24］。類黃酮合成路徑中的關鍵酶查爾酮合成酶在K326中的含量顯著高于云煙87（圖6），將有利于類黃酮的合成，與鄧小華等［26］描述的在相同生態條件下，K326 在香氣質和香氣量上要優于云煙87的表現相一致。

除此之外，類黃酮在煙株的防御和抗逆機制中發揮關鍵性的作用［24］。類黃酮化合物是大多數氧自由基的清除劑，在植物生理學中扮演著重要角色，保護植物免受干旱和寒冷脅迫、紫外線輻射或病原體感染等［27］，同時，類黃酮還具有潛在的藥理價值，如自由基清除、抗氧化、抗炎、抗癌、軟化血管以及抗脂質過氧化等［28］。總之，類黃酮化合物除了在植物生長和環境適應中發揮重要功能，還被證明有利于人類健康。

圖7　谷胱甘肽代謝通路部分Fig. 7 Part of glutathione metabolism pathway

3.2 谷胱甘肽的代謝通路

紅花大金元和云煙87的差異蛋白質覆蓋了谷胱甘肽的代謝通路（圖 6），該通路通過清除自由基和活性氧，以維持細胞正常代謝過程中活性氧自由基的動態平衡［29］。作為通路的主角，谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）組成的一種含巰基的小分子肽［30］，在細胞中以還原型（GSH）和氧化型（GSSG）2種形式存在［31-32］。谷胱甘肽參與細胞生長、分化、死亡和衰老的調節［33］，比如VERNOUX等［34］和CAIRNS等［35］報道擬南芥GSH缺失突變體表型的分析顯示GSH參與胚胎和分生組織的生長。GSH在防御和抵抗各種脅迫，如低溫、干旱、鹽堿、重金屬等條件下發揮著至關重要的作用［32，36］，是植物逆境脅迫應答中的關鍵性蛋白［37］。

圖8　云煙87和紅花大金元中與谷胱甘肽代謝相關酶相對含量的比較Fig. 8 Comparison of relative content of enzymes related to glutathione metabolism between Yunyan87 and Honghuadajinyuan

谷胱甘肽過氧化物酶，磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽S-轉移酶等保護性酶參與谷胱甘肽代謝通路（圖 7）。谷胱甘肽過氧化物酶通過還原過氧化氫、有機羥過氧化物或相應醇類以減輕對機體造成的損傷［38］。對于谷胱甘肽代謝通路的理解有利于研究谷胱甘肽及其相關酶類的變化對細胞功能產生的影響［31］。磷脂過氧化氫物谷胱甘肽過氧化物酶又稱為谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPx4），是谷胱甘肽過氧化物酶家族中第二個被鑒定的細胞內含硒酶［39］，也是GP家族中唯一能還原膜內氫過氧化物的酶［38］。

圖9　3種煙草中抗性相關差異蛋白質蛋白酶抑制劑（A）和超氧化物歧化酶（B）相對含量的比較Fig. 9 Comparison of relative content of differentially expressed proteins related to resistance such as proteinase inhibitor （A） and superoxide dismutase （B） in three tobacco varieties

植物中的谷胱甘肽S-轉移酶通過催化谷胱甘肽與有毒異源物或氧化產物的親核加成以促進該類物質的代謝，實現清除或者區域化隔離［40-41］。谷胱甘肽S-轉移酶具有多元生物功能，在植物抗逆境脅迫以及維持植物的新陳代謝等方面發揮重要作用［42］。EDWARDS等［43］表明谷胱甘肽 S-轉移酶表達的上調可作為植物應對逆境壓力的標志之一。3種保護性酶在紅花大金元中的含量均顯著低于云煙87（圖8）。該結果與張樹堂［12］和解芬等［44］所報道紅花大金元的抗逆性高截然相反，因為逆境條件分為多種多樣，一方面谷胱甘肽代謝相關的酶只覆蓋了抗性的一部分，另一方面他人的研究是關于抗性的綜合性評價，而且煙草的抗逆性與所處的區域環境等也是息息相關，如云煙87在湖北環神農架地區和云南昭通抗赤星病能力均低于 K326和紅花大金元［45-46］，而在酉陽煙區云煙87的赤星病發病率是檢測的10個品種中最低的，低于K326和紅花大金元［47］。由此可見，相關酶類對煙草抗逆性的調節過程是復雜的。

3.3 細胞色素P450相關代謝通路

紅花大金元和K326的差異蛋白質覆蓋的代謝通路涉及細胞色素P450，細胞色素P450是一個龐大而重要的血紅素單氧酶超家族，有著廣泛的酶底物和相應的功能［48］，作用于內質網、線粒體、質體、高爾基體和其他膜性細胞器。該家族不僅參與植物的基本新陳代謝，也參與次生代謝，主要在2個生命過程中發揮功能：（a）次生代謝產物如類黃酮、生物堿、萜類化合物等的生物合成和（b）有毒的外源性化學物質的降解［49-50］。而其中煙草生物堿的合成是其體內有害物質的重要路徑，萜類化合物的代謝是煙草香氣物質的重要來源。由此可見，細胞色素 P450對于提升煙草香味的間接作用非同小可［50］。從圖 10中比較細胞色素P450在紅花大金元中含量高于K326，不能否認細胞色素 P450所產生的次生代謝物在紅花大金元的獨特香味方面所做出的貢獻，但究竟是何種代謝產物占主導地位以及細胞色素 P450的具體調控機制均有待下一步的研究與探討。

圖10　紅花大金元和K326中細胞色素P450相對含量的比較Fig. 10 Comparison of relative content of cytochrome P450 between Honghuadajinyuan and K326

3　.4 抗性相關蛋白質的分析

蛋白酶抑制劑（proteinase inhibitor，PI）是一種廣泛存在于多種植物中抑制蛋白水解酶的小分子蛋白或多肽［51］。一般分為4類：絲氨酸類、半胱氨酸類、天冬氨酸類和金屬類蛋白酶抑制劑［52］。之前有多項證據表明蛋白酶抑制劑具有抗蟲性，其通過抑制植食性昆蟲蛋白水解酶的活性而在植物防御昆蟲的過程中發揮作用，作用的有效性取決于蛋白酶抑制劑與靶向昆蟲消化道內主要蛋白酶之間的親合性和特異性［53］。由于昆蟲腸道內多為絲氨酸蛋白酶，因此，絲氨酸類蛋白酶抑制劑與植物的抗蟲性關系更為緊密。孫興華等［54］認為培育蛋白酶抑制劑含量高或易誘導的黃瓜品種有可能是控制有害昆蟲南美斑潛蠅的有效途徑。HILDER等［55］首次報道 PI在轉基因植物的運用是將豇豆中的胰蛋白酶抑制劑轉入煙草，產生了相對于非轉基因煙草的抗綠棉鈴蟲的煙草品種。JULIA等［52］也驗證了蛋白酶抑制劑可用于提高轉基因植物對昆蟲的抗性。圖9-A中可以看出，紅花大金元與K326中蛋白酶抑制劑的含量相差無幾，而云煙87中蛋白酶抑制劑的含量幾乎不足紅花大金元和K326含量的二分之一。鑒于上文實例，云煙87的抗蟲性有望通過誘導蛋白酶抑制劑的表達而得到進一步的改善。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種抗氧化金屬酶［56］，是煙草抗逆機制中的關鍵酶。根據活性位點金屬輔助因子的不同分為4個分布廣泛且功能重要的亞型：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD［57］。一般通過催化超氧化物自由基生成過氧化氫和氧氣來發揮防御氧化損傷的作用。Fe-SOD在煙草中可能與光合作用有關，Mn-SOD可能與線粒體呼吸，胞質中的生化途徑有關；同樣地，葉綠素中的 Cu/Zn-SOD也與胞質中的生化途徑關系緊密［58］。CAMP等［57］表明SOD的表達在胞質和葉綠素亞型抗逆中的重要性，并表明SOD的活性是植物受到氧化脅迫時抗損傷的一個潛在限速因子，其研究結果顯示，由AhCuZnSOD超表達導致SOD活性水平的上升可能促進由各種環境引起煙草的氧化損傷的恢復。多項研究［14，59-60］均表明SOD的活性與煙草的抗黑脛病能力呈正相關，并且可將SOD的活性作為鑒別黑脛病抗性的生理生化指標之一，由此可見，SOD對煙草黑脛病防御能力的意義重大。圖9-B中顯示SOD在紅花大金元的表達量均要低于K326和云煙87，而紅花大金元是易感黑脛病的［14-15］，也就是SOD在抗黑脛病品種K326和云煙87中高表達而在感黑脛病品種紅花大金元中低表達，這在某種程度上證實了前人的結論，也有助于進一步展開煙草黑脛病與煙草中關鍵性酶相關作用機制的研究。

4　結論

K326和云煙 87的蛋白質表達譜存在一定的相似性，而與紅花大金元相差較大，差異蛋白質的篩選結果也與之吻合。其中部分差異蛋白質參與了光合作用、能量代謝、抗逆境脅迫等重要路徑，在維持煙草正常生理功能，提高生存能力方面發揮關鍵性作用。

References

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（責任編輯 李莉）

Differential Proteomic Research of Three Varieties of Tobacco in China

XU Ying， YAN Guo-quan， ZHANG Yang， YU Hong-xiu
（Institutes of Biomedical Sciences， Fudan University， Shanghai 200032）

【Objective】 In order to strengthen the basic scientific research and cultivation of tobacco， differential proteomics is used to select specific proteins and elucidate metabolic pathways in tobacco. 【Method】 Leaf proteins of three varieties of tobacco in China including Honghuadajinyuan， K326 and Yunyan 87 were extracted by phenol. After digestion the protein profiles of three varieties of tobacco were investigated by using tandem mass tag（TMT） coupled with two-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry （2D LC-MS/MS）. The proteins and peptides from tobacco were identified with MASCOT search engine after spectra extraction in Proteome Discoverer Software. Then， bioinformatics analysis including data correlation analysis， hierarchicalcluster analysis and principal component analysis （PCA） were conducted. Meanwhile， proteins with change ratio of more than 2 fold were defined as differentially expressed tobacco proteins， and they were screened out by volcano plot analysis. Finally， the distribution and function of important proteins in tobacco were analyzed using KEGG pathway analysis. 【Result】 A total of 3 079 proteins in Honghuadajinyuan， K326 and Yunyan 87 were identified and the number of protein ID was 10 343. Protein expression profiles of hierarchical cluster analysis and principal component analysis indicated that K326 and Yunyan 87 were relatively similar，and Honghuadajinyuan was significantly different from the other two. The subsequent protein screening also verified the results. Screening of differentially expressed proteins suggested that there were only 29 proteins differentially expressed between K326 and Yunyan 87. 13 proteins of them covered 8 metabolic pathways including flavonoids biosynthesis. Chalcone synthetase participating in the flavonoids synthesis was significantly higher in K326 than in Yunyan 87. Honghuadajinyuan and Yunyan 87 had 160 differentially expressed proteins. 103 proteins of them covered 42 metabolic pathways including glutathione metabolism. Three kinds of enzymes related to glutathione metabolic pathway including glutathione peroxidase， phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase and glutathione S-transferase were significantly lower in Honghuadajinyuan than in Yunyan 87. Honghuadajinyuan and K326 had 119 differentially expressed proteins. 89 proteins of them covered metabolic pathways such as metabolism of xenobiotics by cytochrome P450. It was indicated that several proteins related to stress resistance such as proteinase inhibitor was much less in Yunyan 87 than in K326 and Honghuadajinyuan， and superoxide dismutase in Honghuadajinyuan was the lowest among the three varieties of tobacco. 【Conclusion】Results of the study revealed that the TMT coupled with 2D LC-MS/MS is a powerful method for isolating and identifying differentially expressed proteins in various tobacco varieties. Most of them are involved in photosynthesis，metabolism or stress resistance.

tobacco； differential proteomics； tandem mass tag； 2D LC-MS/MS

2016-03-14；接受日期：2016-05-20

國家重點基礎研究發展計劃（“973”計劃）（2012AA020201）、煙草化學安徽省重點實驗室開放課題（0920140109008）聯系方式：徐瑩，E-mail：14211510001@fudan.edu.cn。通信作者余紅秀，E-mail：hongxiuyu@fudan.edu.cn