應用CNAS CL-36標準評估HBV DNA定量檢測試劑的抗干擾能力

方　芳　陳柯霖　陳　燕　黃澤玉　呂　虹　劉淑靜　周　金　張國軍　康熙雄

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科，北京 100050)

?

· 檢驗醫學與臨床 ·

應用CNAS CL-36標準評估HBV DNA定量檢測試劑的抗干擾能力

方芳陳柯霖陳燕黃澤玉呂虹劉淑靜周金張國軍康熙雄*

(首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科，北京 100050)

目的評估乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)定量檢測試劑的抗干擾能力。方法選擇臨界值、低值、中值和高值HBV DNA陽性血清樣本，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction， q-RT-PCR)技術檢測1.63～17.25 g/L的血紅蛋白(hemoglobin， Hb)或26.55～497.50 μmol/L的總膽紅素(total bilirubin， TBIL)對HBV DNA陽性樣本檢測結果的干擾，依據中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)CL-36中的評價標準：偏差大于等于±7.5%時，判斷檢測結果受到干擾。結果當Hb濃度為7.75～17.25 g/L時，各樣本均受到干擾；當Hb≤3.50 g/L時，各樣本均未受到干擾。當TBIL濃度為274.60～399.15 μmol/L時，僅HBV DNA=2.24×108IU/mL的樣本檢測未受到干擾；當TBIL=153.55 μmol/L時，僅HBV DNA=4.62×102IU/mL的樣本檢測受到干擾；當TBIL=26.55 μmol/L時，各樣本均未受到干擾。結論該HBV DNA定量檢測試劑具有一定的抗干擾能力：Hb≤3.50 g/L、TBIL≤26.55 μmol/L對檢測結果沒有影響。

乙型肝炎病毒；聚合酶鏈反應；血紅蛋白；總膽紅素；干擾

乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid， HBV DNA)的定量檢測可反映病毒復制水平，主要用于慢性HBV感染的診斷、治療適應證的選擇及抗病毒療效的判斷[1-3]。臨床實驗

室主要采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction， q-RT-PCR)檢測HBV DNA，HBV DNA檢測的準確性將直接影響醫生對患者的診斷和治療。檢驗標本的狀態對檢測結果準確性可產生嚴重影響，ISO15189質量管理體系也明確指出必須對檢測干擾因素進行評估[4]，因此筆者對在臨床實際工作中常見的溶血、黃疸對q-RT-PCR定量檢測HBV DNA的干擾作用進行檢測，并依據《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明(CNAS CL-36)》[4]的評估標準對實驗結果進行了評價。

1　材料與方法

1.1研究對象

1)HBV DNA陽性樣本：選擇無溶血、無高膽紅素血癥、無高脂血癥，丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)及門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)等肝功能生化檢測項目均正常的HBV DNA陽性血清樣本4例，濃度分別為：1號，4.01×108IU/mL；2號，6.44×105IU/mL；3號，3.33×103IU/mL；4號，9.65×102IU/mL，均來源于本院門診乙型肝炎病毒攜帶者。

2)陰性混合血清、EDTA抗凝全血樣本來源于無乙型肝炎病史且HBV DNA陰性、無高膽紅素血癥、無高脂血癥、無溶血的正常體檢者。

3)溶血樣本：提取EDTA抗凝全血樣本中的紅細胞，經0.9%(質量分數)氯化鈉注射液反復洗滌6次，在-20 ℃凍融后溶血，與陰性血清混合，依據EP7-A[5]，分別制備5個濃度的血紅蛋白(hemoglobin，Hb)樣本池：38.25 g/L(高值樣本池)、28.25 g/L(75%樣本池)、17.50 g/L(中值樣本池)、7.75 g/L(25%樣本池)和3.25 g/L(低值樣本池)。

4)高膽紅素血清樣本：用注射用水將純品膽紅素(武漢市長立生物技術有限公司提供)完全溶解后，與陰性血清混合，依據EP7-A[5]，分別制備5個濃度的總膽紅素(total bilirubin， TBIL)樣本池：1 017.50 μmol/L(高值樣本池)、788.60 μmol/L(75%樣本池)、519.10 μmol/L(中值樣本池)、291.80 μmol/L(25%樣本池)和45.40 μmol/L(低值樣本池)。

1.2方法

1)從每個HBV DNA陽性的血清樣本中各取出200 μL分別放入11支0.5 mL離心管中，然后在這11支離心管中分別加入5種不同濃度的溶血樣本、5種不同濃度的高TBIL樣本以及陰性血清200 μL(1∶1稀釋)，制備成含有5種不同濃度的Hb干擾樣本、5種不同濃度的TBIL干擾樣本以及對照樣本。

2)按照試劑說明書分兩批分別檢測受到Hb干擾的樣本和對照樣本及受到TBIL干擾的樣本和對照樣本中的HBV DNA病毒載量，每個樣本重復3次，結果取均值。

3)分別檢測上述干擾樣本中的Hb濃度和TBIL濃度，每個樣本重復4次，結果取均值。

1.3儀器設備及試劑

1)HBV DNA的檢測：采用瑞士Roche Lightcycler 480 Ⅱ檢測，試劑購自湖南圣湘生物技術有限公司。

2)Hb的檢測：采用日本Sysmex 800i血細胞計數儀及其配套試劑。

3)TBIL的檢測：采用日本Hitachi labospect 008 全自動生化分析儀及日本和光(WAKO)的TBIL檢測試劑。

4)質量控制：PCR質控品：試劑盒自帶高值質控品(1.26×105～1.26×106)IU/mL及本實驗室自制的低值質控品(4.25×103～1.01×104)IU/mL。Hb質控品：Sysmex e-CHECK(XS)。TBIL質控品：BIO-RAD Lyphochek Assayed Chemistry Control。上述質控結果均在控，實驗有效。

1.4統計學方法

2　結果

2.1兩種干擾樣本中Hb及TBIL濃度

干擾樣本中的Hb濃度最低為1.63 g/L，最高為(17.25±1.50)g/L；干擾樣本中的TBIL濃度最低為(26.55±0.17) μmol/L，最高為(497.50±5.50)μmol/L，詳見表1。

2.2 不同濃度的Hb對不同濃度的HBV DNA樣本檢測造成的干擾

各HBV DNA陽性樣本經陰性血清1∶1稀釋后作為對照樣本的濃度分別為：1號，1.74×108IU/mL；2號，3.39×105IU/mL；3號，1.67×103IU/mL；4號，4.97×102IU/mL。與對照相比，以偏差低于±7.5%為實驗可接受范圍，當Hb濃度≥7.75 g/L時，各樣本均受到干擾；當Hb濃度≤3.50 g/L時，各樣本均未受到干擾，詳見表2。Hb的濃度越高，對擴增的影響越大，擴增熒光強度越低，擴增效率越低，CT值越高(圖1)。

表1　Hb干擾樣本和TBIL干擾樣本中的Hb濃度和TBIL濃度

表2　不同濃度的Hb對不同濃度的HBV DNA樣本檢測造成的干擾

*Logarithm of HBV DNA concentration； Hb： hemoglobin； HBV DNA： hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

圖1　不同濃度的Hb對HBV DNA 濃度為

A: control； B: Hb=1.63 g/L； C: Hb=3.50 g/L； D： Hb=7.75 g/L； E： Hb=13.50 g/L； F：Hb=17.25 g/L;Hb： hemoglobin； HBV DNA： hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

2.3 不同濃度的TBIL對不同濃度的HBV DNA樣本檢測造成的干擾

各HBV DNA陽性樣本經陰性血清1∶1稀釋后作為對照樣本的濃度分別為：1號，2.24×108IU/mL；2號，2.88×105IU/mL；3號，1.67×103IU/mL；4號，4.62×102IU/mL。與對照相比，以偏差低于±7.5%為實驗可接受范圍，當TBIL≥497.50 μmol/L時，各樣本均受到干擾；當TBIL濃度為274.60～399.15 μmol/L時，僅HBV DNA=2.24×108IU/mL的樣本檢測未受到干擾；當TBIL=153.55 μmol/L時，除HBV DNA=4.62×102IU/mL的樣本檢測受到干擾外，其余樣本均未受到干擾；當TBIL≤26.55 μmol/L時，各樣本檢測均未受到干擾，詳見表3。TBIL的濃度越高，對擴增的影響越大，擴增熒光強度越低，擴增效率越低，CT值越高(圖2)。

表3　不同濃度的TBIL對不同濃度的HBV DNA樣本檢測造成的干擾

*Logarithm of HBV DNA concentration； TBIL： total bilirubin； HBV DNA：hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

圖2　不同濃度的TBIL對HBV DNA 濃度為2.24×108 IU/mL的檢測樣本的影響

A: control； B: TBIL=26.55 μmol/L； C: TBIL=153.55 μmol/L； D： TBIL=274.60 μmol/L； E： TBIL=399.15 μmol/L； F： TBIL=497.50 μmol/L; TBIL:total bilirubin； HBV DNA： hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

3　討論

q-RT-PCR技術檢測HBV DNA的病毒載量，靈敏度高、特異度好，能夠有效避免環境污染和樣本的交叉污染，在臨床得到廣泛應用，但是其定量的準確性易受到樣本中干擾物質的影響。因此筆者依據CNAS CL-36的要求，對該試劑的抗干擾能力進行評價。

在評價q-RT-PCR檢測HBV DNA的干擾因素的影響程度時，筆者未查到統一的判斷標準。在CNAS CL-36中推薦的關于對耗材抑制物的驗收判斷標準：可用新、舊批號耗材檢測同一批數個樣品，其中陽性樣本應包括：臨界值、低值、中值和高值樣品，定量檢測結果的偏倚小于±7.5%且陰性和臨界值樣品符合預期，即判斷耗材的抑制物符合實驗要求[4]。筆者將樣本中的血紅蛋白、總膽紅素對樣本檢測結果的干擾作用在一定程度上視為是對定量PCR實驗的抑制因素，因此引用偏差小于±7.5%的標準作為判斷本實驗抗干擾能力的標準，并分別使用臨界值、低值、中值和高值的HBV DNA陽性的樣本進行檢測。這一判斷方法較以往文獻中使用的通過比較樣本的擴增效率[8]、配對比較干擾與非干擾樣本的檢測結果[9]等方法簡便易行，工作量小。

血紅蛋白是紅細胞內的主要PCR抑制物，它含有鐵元素，其抑制機制可能與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關。研究鐵的抑制效應[10]時發現，鐵干擾DNA 的合成，而膽紅素是血紅蛋白的衍生物，也是PCR的抑制劑。有研究[10]表明，亞鐵血紅素可抑制DNA聚合酶活性。氯化高鐵血紅素通過直接作用于DNA聚合酶，成為一個與靶DNA競爭的抑制劑和核苷酸的非競爭性抑制劑。此外，該研究[10]表明，1%血液可完全抑制Taq酶活性，而與Mg離子濃度無關。而本研究使用的DNA聚合酶即為Taq酶，因此檢測結果明顯受到溶血的影響。

本研究結果顯示，對于同一個HBV DNA陽性樣本，血紅蛋白濃度、總膽紅素濃度越高，對PCR的干擾作用越大；在同一干擾濃度下，HBV DNA濃度越低，越容易受到干擾物質的影響。若DNA濃度高(2.24×108IU/mL)，即使高濃度的TBIL(399.15 μmol/L)也不會對結果構成明顯的影響(偏差為 -6.83%)。如果干擾物質為Hb，即使是高濃度的HBV DNA樣本(1.74×108IU/mL)也僅在濃度為Hb≤3.5 g/L時不會對結果造成明顯的影響。但是對于HBV DNA濃度本身就低的樣本(4.62×102IU/mL)，即使樣本中的TBIL濃度較低(153.55 μmol/L)，檢測結果也會出現明顯的偏差(-9.92%)。這些提示筆者在臨床工作中必須重視樣本中干擾物質對檢測結果的影響，盡量避免干擾物質對檢測干擾，例如將溶血樣本退回臨床，重新抽取合格的樣本檢測。對不能避免的干擾，如無法重新抽血或患者黃疸的情況下，在判斷檢測結果是否會受到干擾物質的影響時，應主要考慮3個因素：干擾物質的濃度、干擾物質的種類、樣本中含有待測核酸的濃度，必要時通過抗干擾手段進行干預，例如以陰性血清稀釋待測樣本以降低干擾物質濃度從而避免假陰性結果，但同時還必須注意避免因樣本本身含有DNA量過低，而導致稀釋后檢測結果的假陰性。

本研究表明：該HBV DNA定量檢測試劑具有一定的抗干擾能力：血紅蛋白≤3.50 g/L、總膽紅素≤26.55 μmol/L對檢測結果沒有影響。應用CNAS CL-36的判斷標準來評價q-RT-PCR實驗中的干擾因素影響的方法簡便易行。

[1]中華醫學會肝病學會分會，中華醫學會感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)[J]. 中華肝臟病雜志， 2015， 23(12)： 888-904.

[2]歐曉娟，王曉明，賈繼東，等. 慢性乙型肝炎肝穿病理與血清HBV DNA及肝功能的關系[J]. 首都醫科大學學報，2006，27(4)：435-437.

[3]單晶，丁惠國. 乙型肝炎病毒基因型與血清型的關系及臨床意義[J]. 首都醫科大學學報，2004，25(4)：557-559.

[4]中國合格評定國家認可委員會. CNAS CL-36醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明[EB/OL].(2015-11-11)[2016-04-01]. https：//www.cnas.org.cn/rkgf/sysrk/rkyyzz/2015/12/873732.shtml.

[5]Powers D， Boyd J， Glick M， et al.EP7-A Interference Testing in Clinical Chemistry； Approved Guideline[S]. Wayne：NCCLS， 2002：9-22.

[6]廖萍，周文杰，張霞，等. SYSMEX CS-5100全自動血凝儀的抗干擾性能研究[J]. 血栓與止血， 2015， 21(1)： 5-9.

[7]張偉堅，劉光明，梁鳳瓊. 普利生C2000-A全自動血凝儀的性能驗證[J]. 南昌大學學報：醫學版，2014， 54(6)：16-20.

[8]余南，陳小堅，甘明，等.脂血標本的核酸定量檢測效果評價[J].熱帶醫學雜志，2007，7(5)：429-432.

[9]雷澤洪，黃勝起，陳振翅. 血紅蛋白和肝素對FQ-PCR檢測HBV DNA結果的影響[J].中國熱帶醫學，2008，8(7)：1235-1236.

[10]李金明. 實時熒光PCR技術[M]. 北京：人民軍醫出版社，2014：72.

編輯陳瑞芳

Evaluation of anti-interference capability of HBV DNA quantitative reagents according to CNAS CL-36 criterion

Fang Fang， Chen Kelin， Chen Yan， Huang Zeyu， Lyu Hong， Liu Shujing， Zhou Jin， Zhang Guojun， Kang Xixiong*

(DepartmentofClinicalLaboratory，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

ObjectiveTo evaluate the anti-interference capability of hepatitis B virus (HBV) deoxyribonucleic acid (DNA) quantitative reagents. MethodsHBV DNA positive serum samples with critical concentrations, low, medium and high were collected. The analysis of interference was performed in four HBV DNA positive samples with hemoglobin (Hb) ranging from 1.63 to 17.25 g/L or total bilirubin (TBIL) ranging from 26.55 to 497.50 μmol/L by quantitative real-time polymerase chain reaction (q-RT-PCR). According to criterion of China National Accreditation Service for Conformity Assessment (CNAS) CL-36, if the bias is higher than and equal to ±7.5%, there will be interference with the detection of HBV DNA. ResultsAll of the HBV DNA positive sample were subjected to interference with Hb ranging from 7.75 to 17.25g/L, and were not subjected to interference with Hb less than or equal to 3.50 g/L. For TBIL ranging from 274.60 to 399.15 μmol/L, the sample with HBV DNA viral load 2.24×108IU/mL was the only one without interference. For TBIL=153.55μmol/L，only the sample with HBV DNA viral load 4.62×102IU/mL was subjected to interference. None of the HBV DNA positive sample were subjected to interference with TBIL less than or equal to 26.55μmol/L. ConclusionThe HBV DNA quantitative reagent has certain anti-interference capability: there was no interference effect on HBV DNA results when Hb is less than or equal to 3.50 g/L and TBIL is less than or equal to 26.55 μmol/L.

hepatitis B virus；PCR；hemoglobin；total bilirubin；interference

北京市衛生系統高層次人才培養計劃基金(2013-3-052)。This study was supported by the High Level Technical Talent Development of Beijing Health System(2013-3-052)

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.04.016]

R 446

2016-04-30)

*Corresponding author， E-mail：kangxx@vip.sina.com

網絡出版時間：2016-07-2020∶48網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160714.2048.002.html