五味子乙素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響及其機(jī)制探討

呂紅，蘇子博，付仁，鄭立影，潘正，齊玲，金宏

(吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 132013)

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·論著·

五味子乙素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響及其機(jī)制探討

呂紅，蘇子博，付仁，鄭立影，潘正，齊玲，金宏

(吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 132013)

目的觀察五味子乙素(Sch B)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。方法培養(yǎng)U87細(xì)胞，分為A、B、C、D組，D組加入含5%血清的培養(yǎng)液200 μL，A、B、C組分別加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培養(yǎng)液，比較各組細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞周期及細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2。結(jié)果與D組比較，A、B、C組48 h和72 h的細(xì)胞OD值降低(P均<0.05)。與A、D組比較，B組Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2的A值及陽(yáng)性表達(dá)率高(P均<0.05)。與D組比較，C組Caspase-3、Bax/Bcl-2的A值及陽(yáng)性表達(dá)率高(P均<0.05)。與A組相比，C組Caspase-3的A值及陽(yáng)性表達(dá)率高(P均<0.05)。與D組比較，A組G1期、G2/M期細(xì)胞比例增加,P均<0.05。結(jié)論Sch B能明顯抑制U87細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈一定的量效關(guān)系；其機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

五味子乙素；腦膠質(zhì)瘤；Caspase-3蛋白；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，由于腫瘤所在位置極為特殊，對(duì)人體的影響和危害很大。目前，對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)和化療為主，但化療藥物不良反應(yīng)大，且易產(chǎn)生耐藥性[1]。五味子為木蘭科植物，具有保肝、抗氧化、抗衰老等作用，是一種上品中藥。研究[2～5]表明，五味子具有一定的抗腫瘤活性，乙素則是其中的一種抗腫瘤有效成分，其通過(guò)多種途徑發(fā)揮著作用。本研究觀察了五味子乙素(Sch B)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物及試劑U87細(xì)胞由吉林大學(xué)提供。Sch B，白色結(jié)晶，用DMSO配成濃度20 mg/mL備用，置于4 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)再用高糖培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。DMEM培養(yǎng)基 (Thermo公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，胰蛋白酶(EDTA，Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO，Thermo公司)。Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2U87細(xì)胞培養(yǎng)將U87細(xì)胞接種于含F(xiàn)BS濃度為10%的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換液1次。

1.3U87細(xì)胞增殖情況觀察采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，接種于平底96孔板中，使細(xì)胞數(shù)為1×104/孔。培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后分為A、B、C、D組，D組加入含5%血清的培養(yǎng)液200 μL，A、B、C組分別加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培養(yǎng)液，各組作用24、48、72 h后棄上清。用MTT還原法在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度值(OD值)，用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.4U87細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2檢測(cè)①ELISA法:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的U87細(xì)胞接種于放有無(wú)菌玻片的24孔板中，分為A、B、C、D組，D組加入含5%血清的培養(yǎng)液200 μL，A、B、C組分別加入含50、100、200 μg/mL Sch B的等量培養(yǎng)液，作用72 h，每組5個(gè)復(fù)孔。取培養(yǎng)上清，與包被液以1∶1比例加入96孔酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜。37 ℃封閉1.5 h，加入Caspase-3、Bax和Bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜。次日加入二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1.5 h，DAB避光顯色，有顏色變化時(shí)終止，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A值)。②免疫組化法:分組及各組干預(yù)方法同上，作用72 h后吸出上清，10%甲醛固定30 min，空氣干燥；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活；一抗4 ℃過(guò)夜，滴加試劑1，37 ℃、20 min，加試劑2，37 ℃、30 min，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫性分布黃色到棕褐色顆粒定義為陽(yáng)性，計(jì)數(shù)Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性表達(dá)率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5U87細(xì)胞周期觀察采用流式分析儀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，1×106接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24 h后加入Sch B(濃度為200、0 μg/mL)，分別計(jì)為A、D組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化后用80%冷甲醇固定過(guò)夜，經(jīng)Annexin V/PI染色，上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞周期。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞OD值比較細(xì)胞OD值見(jiàn)表1。

表1　各組細(xì)胞OD值比較

注：與D組比較，△P<0.05。

2.2各組細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽(yáng)性表達(dá)率比較細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽(yáng)性表達(dá)率比較見(jiàn)表2。

表2　各組細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：與D組比較，△P<0.05；與A組比較，※P<0.05。

2.3兩組細(xì)胞周期比較A組和D組G1期細(xì)胞分別為8.10%、3.12%，G2/M期細(xì)胞分別為16.17%、12.28%，兩組比較，P均<0.05；A組和D組G0/G1期細(xì)胞分別為52.37%、58.95%，S期細(xì)胞分別為23.36%、25.65%，兩組比較，P均>0.05。

3　討論

腦膠質(zhì)瘤是惡性程度較高的原發(fā)性腫瘤，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)，約占顱內(nèi)腫瘤的45%[6]。惡性膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)呈浸潤(rùn)性，邊界不清楚，手術(shù)難根除，具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、病死率高和治愈率低的特點(diǎn)，目前沒(méi)有滿意的治療方法[7]。齊玲等[8,9]通過(guò)對(duì)人新鮮腦腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分離，直接培養(yǎng)，獲得腦腫瘤干細(xì)胞；這種干細(xì)胞的存在可能是導(dǎo)致腦腫瘤發(fā)生、耐藥以及復(fù)發(fā)的根源。

五味子是常用的滋補(bǔ)固澀類(lèi)中藥，性味溫和，具補(bǔ)益強(qiáng)壯之功、奏固澀生津之效，對(duì)心、肝、脾、肺、腎發(fā)揮平衡作用[10]，能明顯影響機(jī)體多種組織器官的生物學(xué)活性[11]。Sch B作為五味子的主要活性成分之一，在抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用[12,13]。最近研究[14]發(fā)現(xiàn)，Sch B低、中、高劑量組均可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)激活p38MAPK/p53信號(hào)通路來(lái)參與抗腫瘤作用。Sch B聯(lián)合順鉑對(duì)H22腫瘤的抑制作用比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)效果更強(qiáng)，具有一種類(lèi)似正反饋的作用使細(xì)胞凋亡，其抗瘤作用與抑癌基因p53的高表達(dá)相關(guān)[15]。Sch B對(duì)多柔比星使用過(guò)程中產(chǎn)生的心臟毒性有限制作用，同時(shí)顯著增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)SMMC7721、MCF-7的凋亡能力[16]。Sch B還能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、NF-κB、PARP、CDK-4的表達(dá)來(lái)引導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡[17]。

本課題組前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，高濃度Sch B能夠抑制U87細(xì)胞的增殖，但并未進(jìn)一步研究其機(jī)制。Caspase-3是凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶，起著最終樞紐作用[19]。Bcl-2也是一個(gè)調(diào)解細(xì)胞凋亡的重要基因，其表達(dá)升高可抑制細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)ax的作用與Bcl-2相反，二者產(chǎn)生負(fù)反饋?zhàn)饔茫绊懠?xì)胞存活，通過(guò)二者的比值，可了解細(xì)胞的生存狀況[20]。本研究顯示，與D組比較，A、B、C組細(xì)胞OD值降低，Caspase-3、Bax、Bcl-2 A值及陽(yáng)性表達(dá)率升高，G1期及G2/M期細(xì)胞比例高。提示Sch B能明顯抑制U87細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈一定的量效關(guān)系；其機(jī)制可能與上調(diào)Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

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Influence of Schisandrin B on proliferation of glioma U87 cells and its mechanism

LYU Hong, SU Zibo, FU Ren, ZHENG Liying, PAN Zheng, Qi Ling, JIN Hong

(Clinical Medical College of Jilin Medical College, Jilin 132013, China)

Objective To investigate the effect of Schisandrin B (Sch B) on the proliferation of glioma U87 cells and to explore its possible mechanism. MethodsGlioma U87 cells were cultured and were divided into groups A, B, C and D. Group D was added with culture solution that containing 5% serum 200 μL, and groups A, B and C were added with the same amount of nutrient solution which respectively contained 50, 100 and 200 μg/ml Sch B. The cell proliferation was compared between these groups. The cell cycle and the expression of Caspase-3, Bax, Bcl-2 and Bax/Bcl-2 were respectively detected by ELISA and immunohistochemistry. ResultsCompared with group D, the A value at 48 h and 72 h in the groups A, B and C was decreased. Compared with groups D and A, the A values of Caspase-3, Bax and Bax/Bcl-2 and the positive expression rate of group B were increased (all P<0.05). Compared with group D, the A values of Caspase-3 and Bax/Bcl-2, and the positive expression of group C were increased (all P<0.05). Compared with group A, the A value of Caspase-3 and the positive expression rate of group C were increased (all P<0.05). Compared with group D, the cell percentage of the G1 and G2/M phases of group A was increased, all P<0.05. ConclusionSch B can significantly inhibit the proliferation of U87 cells, induce the apoptosis, and it has a dose-effect relationship, whose mechanism may be related with the up-regulation of Caspase-3, Bax and Bcl-2 expression.

Schisandrin B; glioma; Caspase-3 protein; Bax protein; Bcl-2 protein

吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2014039)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(吉科教合字2015第408號(hào))。

呂紅(1992-)，女，本科，主要研究方向?yàn)槟X腫瘤藥物。E-mail: lvhong1026@163.com

簡(jiǎn)介：金宏(1975-)，女，碩士，副教授，主要研究方向?yàn)槟X腫瘤藥物。E-mail: jinhong0706@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.001

R739.4

A

1002-266X(2016)15-0001-03

2015-11-09)