5-氮雜脫氧胞苷對膠質母細胞瘤細胞U87增殖的影響及其機制探討

沈軍，邵雪非，徐宗華，江曉春，徐善水

(皖南醫學院弋磯山醫院，安徽蕪湖 241001)

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5-氮雜脫氧胞苷對膠質母細胞瘤細胞U87增殖的影響及其機制探討

沈軍，邵雪非，徐宗華，江曉春，徐善水

(皖南醫學院弋磯山醫院，安徽蕪湖 241001)

目的觀察5-氮雜脫氧胞苷對膠質母細胞瘤細胞U87增殖的影響，并探討其可能機制。方法采用不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L)5-氮雜脫氧胞苷作用于U87細胞，比較細胞增殖抑制率和Bcl-2腺病毒E1B19kDa相關蛋白3 mRNA(BNIP3 mRNA)；將5 μmol/L的5-氮雜脫氧胞苷作用于U87細胞0、1、2、3、4、5、6 d，比較細胞增殖抑制率及BNIP3 mRNA。將5 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷作用于U87細胞4 d，并分別添加和不添加Caspase抑制劑Boc-D-FMK，測算細胞增殖抑制率。結果5-氮雜脫氧胞苷對U87細胞增殖有抑制作用，且呈劑量及時間依賴性(P均<0.05)，抑制作用最強的濃度為5 μmol/L，最強的時間點為4 d；Boc-D-FMK并不能抑制由BNIP3所誘導的細胞凋亡，P>0.05。結論5-氮雜脫氧胞苷可抑制U87細胞增殖，其機制可能與BNIP3 mRNA表達上調有關。

5-氮雜脫氧胞苷；膠質母細胞瘤；Bcl-2腺病毒E1B19kDa相關蛋白3

膠質母細胞瘤是中樞神經系統惡性程度最高的神經上皮性腫瘤，其發生發展與抑癌基因、癌基因的改變密切相關[1]。Bcl-2腺病毒E1B19kDa相關蛋白3(BNIP3)是Bcl-2家族中BH3-only亞家族成員之一，具有BH3結構域和跨膜結構域，主要定位于線粒體外膜，通過其跨膜結構域與其他蛋白相互作用而發揮其功能。BNIP3屬促凋亡蛋白，其表達異常參與多種腫瘤的發生發展[2,3]，表達水平主要與其啟動子甲基化狀態有關，應用甲基化抑制劑后能明顯上調BNIP3表達，而促進腫瘤細胞凋亡。我們前期研究[4]表明，BINP3在膠質母細胞瘤組織及細胞中呈陽性表達。本研究觀察了甲基化抑制劑5-氮雜脫氧胞苷對膠質母細胞瘤細胞U87增殖的影響，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1細胞、藥物及試劑U87細胞購于中科院細胞所；5-氮雜脫氧胞苷、瓊脂糖、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍購于Sigma公司，進口胎牛血清(FBS)、DMEM培養液購自Gibco公司，Boc-D-FMK購于上海玉搏公司，總RNA提取劑(TRIzol Reagent)購自美國invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，PCR反應體系購自上海Promega公司，DNA Marker，6×loading buffer購自TaKaRa公司，BNIP3引物及內參引物由上海生工公司設計。

1.2U87細胞培養U87細胞按照1×103/mL接種于25 mL培養瓶，5%CO2飽和濕度，37 ℃培養箱培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長情況。細胞離心，用營養液吹打均勻后分裝進行傳代培養，備用。

1.35-氮雜脫氧胞苷對U87細胞增殖影響觀察采用MTT法。將1×103/mL的U87細胞懸液接種于96孔板；培養48 h后，分別以0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L的5-氮雜脫氧胞苷進行干預，每組設3個復孔。3 d后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續孵育4 h，離心后吸去上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min，使用酶標儀于540 nm波長處測量光密度值(OD值)。根據結果取5-氮雜脫氧胞苷最強作用濃度(5 μmol/L)，分別干預0、1、2、3、4、5、6 d，終止培養，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續孵育4 h，離心后吸去上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min，酶聯免疫檢測儀540 nm波長比色。取5-氮雜脫氧胞苷最強作用濃度(5 μmol/L)、最佳作用時間(4 d)，分別添加和不添加Boc-D-FMK 20 μM，繼續孵育4 h，離心后吸去上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min，使用酶聯免疫檢測儀于540 nm波長處測量光密度值(OD值)。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.45-氮雜脫氧胞苷對U87細胞BNIP3 mRNA表達影響觀察實驗采取的5-氮雜脫氧胞苷劑量及干預時間同1.3。用TRIzol抽提液提取RNA，RNA以紫外分光光度計重復測量3次濃度和純度，按樣品260～280 nm的OD值確定RNA的質量，A260 nm/A280 nm在1.8～2.0視為總RNA純度高。逆轉錄cDNA模板25 μL反應體系；Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，Nuclease-Free Water 8.5 μL，上下游引物各1 μL，逆轉錄cDNA模板2 μL，在冰上操作。引物設計：BNIP3：5′-GGTCAAGTCGGCCGGAAAATAT-3′，5′-CGCCTTCCAATATAGATCCCCAA -3′，198 bp；擴增內參照磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，5′-ATGAGCCC-AGCCTTCTCCAT-3′。PCR反應條件：預變性95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環；72 ℃、10 min。GAPDH反應條件同前。反應體系實驗結束后，取6 μL的PCR產物，在1.0 g/100 mL瓊脂糖凝膠90 V恒壓電泳30 min，在紫外燈照射下利用凝膠成像系統和捷達凝膠分析軟件4.0進行拍照和灰度值測定，各實驗組呈現出來的BNIP3基因PCR產物灰度值分別除以相對應內參GAPDH基因PCR產物灰度值，從而得到BNIP3 mRNA的相對表達量。

2　結果

2.1各組細胞增殖抑制率比較0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預后，細胞增殖抑制率分別為0、1.20%±0.56%、8.62%±1.56%、15.91%±2.59%、21.43%±3.24%、19.33%±3.86%，0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷分別與0 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷比較，P均<0.05。5 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預0、1、2、3、4、5、6 d，細胞增殖抑制率分別為0、7.51%±1.62%、10.04%±2.63%、15.74%±3.46%、18.26%±3.23%、17.63%±2.87%、16.42%±3.16%，1、2、3、4、5、6 d分別與0 d比較，P均<0.05。添加和不添加Boc-D-FMK的細胞增殖抑制率分別為16.38%±3.12%、15.97%±2.93%，兩者比較，P>0.05。

2.2各組細胞BNIP3 mRNA相對表達量比較0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預后，BNIP3 mRNA相對表達量分別為0.12±0.03、0.23±0.05、0.302±0.06、0.518±0.09、0.735±.011、0.187±0.02，0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷分別與0 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷比較，P均<0.05。5 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預0、1、2、3、4、5、6 d，BNIP3 mRNA相對表達量分別為0.451±0.07、0.487±0.07、0.596±0.11、0.782±0.13、0.814±0.15、0.472±0.08、0.563±0.09，1、2、3、4、6 d分別與0 d比較，P均<0.05。

3　討論

膠質母細胞瘤是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質瘤，腫瘤位于皮質下，多數生長于幕上大腦半球各處，呈浸潤性生長，常侵犯多個腦葉，并侵犯深部結構，還可經胼胝體波及對側大腦半球，發生部位以額葉最多見。膠質母細胞瘤病程短，術后易復發，且多數在短期內復發，中位生存期僅27周[5]。近年來，隨著術后綜合治療方法的提高，膠質母細胞瘤的預后稍有改善，但其中位生存期也只有12～15個月[6]，效果仍不理想。

BNIP3表達升高或沉默均可導致腫瘤發生，其表達水平升高可能與非小細胞型肺癌[7]、乳腺癌[8,9]、前列腺癌[10,11]、膽管癌[12]、唾液腺表性癌[13]及子宮內膜癌[14]等發生發展密切相關，甚至參與了腫瘤的轉移[15，16]。但有研究[17～19]表明，BNIP3表達沉默亦可能參與了不同腫瘤的發生發展，如胰腺癌、結直腸癌和胃癌等，主要為消化系統腫瘤。之前我們研究[4]發現，BNIP3不論在膠質母細胞瘤細胞系還是組織標本中，其表達均明顯升高，這與Burton等[20]的研究結果一致，而在正常的腦組織中則未檢測到其表達。Burton等[21]隨后再次研究,認為在膠質母細胞瘤細胞系中，BNIP3雖然表達增加，但其主要位于細胞核內，而且下調了DR5的表達，這都限制了其正常的促進細胞死亡的功能。Chen等[22]則認為在膠質母細胞瘤細胞系中，Mcl-1和BNIP3同時集中存在，而低氧環境下Mcl-1則正好限制了BNIP3介導細胞死亡的功能。

BNIP3表達沉默主要與其啟動子區域CpG島的甲基化狀態有關，如去除啟動子區域的甲基化狀態，則能使其表達水平明顯升高，進而促進腫瘤細胞凋亡[23～25]。Abe等[17]研究表明，在含氧量正常的12種胰腺癌細胞系中，BNIP3表達水平各不相同，有50%未檢測到BNIP3表達，但采用5-氮雜脫氧胞苷干預后，可重建該基因的表達，并能在低氧情況下介導腫瘤細胞死亡。Murai等[18]發現，BNIP3在結直腸癌、胃癌中表達沉默，但應用5-氮雜脫氧胞苷干預后，可使該基因表達增強，并誘導腫瘤細胞死亡。BNIP3在膠質母細胞瘤中并沒有表達沉默，但采用5-氮雜脫氧胞苷干預后，可使BNIP3在膠質母細胞瘤細胞系中表達升高，且呈時間和劑量依賴性。另外發現，5-氮雜脫氧胞苷能明顯抑制U87細胞增殖，雖然沒有直接檢測BNIP3啟動子區域的甲基化狀態，但結合文獻及試驗結果，間接證明在膠質母細胞瘤中，BNIP3啟動子的甲基化狀態限制了其表達，去除其甲基化狀態能抑制U87細胞增殖而達到治療效果。目前，對于BNIP3引起腫瘤細胞死亡的確切機制尚不清楚，可能的機制包括細胞壞死、細胞凋亡和自體吞噬作用[26～28]，其功能的實現是半胱天冬酶依賴性還是非依賴性也有爭論，我們通過實驗發現，BNIP3在多形性膠質細胞瘤中發揮其功能屬于半胱天冬酶非依賴性，但具體機制仍需進一步研究。

BNIP3表達升高還可能會增加化療與放療的敏感性。Ishiguro等[19]采用5-氮雜脫氧胞苷聯合依立替康與單用依立替康分別作用于人結腸癌細胞系，發現前者BNIP3表達明顯升高，且其對腫瘤細胞的增殖效應明顯優于后者，提示BNIP3可能增加了腫瘤細胞對依立替康的敏感性。Wang等[29]將BNIP3轉染至人子宮頸癌細胞系中，轉染后的細胞系凋亡率明顯增加，隨著BNIP3的表達升高，腫瘤細胞對放療的敏感性也逐漸增強。此外，BNIP3可以與bax形成異二聚體共同促進細胞凋亡[2]，同時有研究[30]表明5-氮雜脫氧胞苷也能通過其去甲基化作用調節p53-bax凋亡通路促進腫瘤細胞凋亡，也能通過其去甲基化作用使p14、p16、XAF1等基因表達升高[14]。結合前期研究表明，BNIP3在膠質母細胞瘤中呈陽性表達，5-氮雜脫氧胞苷能明顯上調其表達水平而發揮對腫瘤細胞的抑制效應，BNIP3促進細胞凋亡機制是通過Caspase非依賴性。但BNIP3誘導膠質母細胞瘤細胞死亡的機制以及5-氮雜脫氧胞苷對膠質母細胞瘤凋亡通路中其他相關基因的作用機制尚不清楚，需要我們進一步深入研究。

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Effect of 5-aza-deoxycytidine on proliferation of glioblastoma U87 cells and the mechanism

SHEN Jun, SHAO Xuefei, XU Zonghua, JIANG Xiaochun, XU Shanshui

(The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, China)

ObjectiveTo observe the effect of 5-aza-deoxycytidine on the proliferation of glioblastoma U87 cells and to investigate its possible mechanism.MethodsDifferent concentrations of 5-aza-deoxycytidine (5-aza-deo) (0, 0.1, 0.5, 1.0, 5, 10 μmol/L) were used to interfere in the U87 cell line. After 3 days, the inhibition rate of cell proliferation and the BCL2/adenovirus E1B19kDa protein-interacting protein 3 mRNA (BNIP3 mRNA) expression were compared. After 5 μmol/L 5-aza-deo was used to interfere in U87 cell line at variant time (0, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 d), the inhibition rate of cell proliferation and the BNIP3 mRNA expression were examined. The inhibition rate of cell proliferation was examined after 5 μmol/L 5-aza-deo was used to treat U87 cells for 4 d with Boc-D-FMK or without Boc-D-FMK. Results5-aza-deo inhibited the U87 cell proliferation which showed a time- and dose-dependent manner (all P<0.05). The concentration with the maximum inhibition was 5 μmol/L. The time of maximum inhibition was the 4th day. Boc-D-FMK did not change the apoptosis of U87 cell induced by BNIP3 (P>0.05). Conclusion5-aza-deo can inhibit the U87 cell proliferation, and its mechanism may be related with the up-regulation of BNIP3 mRNA expression.

5-aza-deoxycytidine; glioblastoma; Bcl-2/adenovirus E1B19kDa protein-interacting protein 3

皖南醫學院中青年自然科學基金(WK2014F05)。

沈軍(1984-),男，碩士，住院醫師，主要研究方向為膠質瘤的基礎及臨床。E-mail: shenyuanziyan@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.003

R739.4

A

1002-266X(2016)15-0008-04

2015-11-20)