安定對高皮質激素血癥小鼠絕望樣行為的改善作用及其機制探討

邵靖，戴建國，馬健

(南京中醫藥大學基礎醫學院，南京 210023)

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·基礎研究·

安定對高皮質激素血癥小鼠絕望樣行為的改善作用及其機制探討

邵靖，戴建國，馬健

(南京中醫藥大學基礎醫學院，南京 210023)

目的觀察安定對高皮質激素血癥小鼠絕望樣行為的改善作用，并探討其可能機制。方法將50只C57BL/6N小鼠隨機分為A、B、C、D、E組各10只，A、B、C、D組均制備高皮質激素血癥模型，E組不作任何處理。制模后，D、E組以蒸餾水灌胃，A、B、C組分別以0.1 mg/kg安定、0.2 mg/kg安定、3.6 mg/kg鹽酸氟西汀灌胃，1次/d，連續4周。觀察各組小鼠絕望樣行為(懸尾不動時間、游泳不動時間)，Western blotting法檢測海馬組織神經微絲蛋白輕鏈(NF-L)和突觸素(SYP)。結果與E組比較，D組懸尾不動時間短，游泳不動時間長；與D組比較，A、B、C組懸尾不動時間長，游泳不動時間短；P均<0.05。與E組比較，D組NF-L、SYP相對表達量降低；與D組比較，A、B、C組的NF-L、SYP相對表達量升高；P均<0.05。結論安定可改善高皮質激素血癥小鼠絕望樣行為，其機制可能與上調NF-L、SYP表達有關。

安定；高皮質激素血癥；絕望樣行為；神經微絲蛋白輕鏈；突觸素

高皮質激素血癥患者因多種原因導致血漿皮質激素水平升高，常與精神壓力過大所致長期慢性應激，或臨床應用皮質激素導致的血漿皮質激素水平上升有關，可引起焦慮、抑郁等臨床癥狀[1]。長時間血漿中皮質激素維持在一定的高水平，可導致抑郁癥，對人體神經系統有嚴重損害，甚至可致神經元死亡。迄今尚未發現能對抗高皮質激素血癥致神經損傷的特效藥物，因其發病部位主要位于腦部，一般臨床醫師采用作用于神經系統或腦血管的藥物。安定具有鎮靜、抗驚厥等作用，可作為預防應激和治療抑郁癥患者的主要治療藥物之一，但其對高皮質激素血癥引發的絕望樣行為是否有影響以往鮮有報道。本研究觀察了安定對高皮質激素血癥小鼠絕望樣行為的影響，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物雄性C57BL/6N小鼠50只，體質量20～24 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心動物房，溫度(23±1)℃，相對濕度40%～70%，明暗交替時間為12 h(6∶00～18∶00開燈)，自由飲食、飲水。

1.2藥品及試劑安定購自江蘇濟川制藥有限公司，皮質酮購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，鹽酸氟西汀購自蘇州制藥有限公司。β-actin和突觸素(SYP)單克隆抗體購自Santa Cruz公司(SC81178和SC17750)，小鼠神經微絲輕鏈(NF-L)單克隆抗體購自Invitrogen公司，HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自Gene Script公司；其他試劑均為分析純，購自南京化學試劑公司。

1.3高皮質激素血癥模型制備及安定的用法將50只C57BL/6N小鼠隨機分為A、B、C、D、E組各10只，A、B、C、D組均制備高皮質激素血癥模型，E組不作任何處理。制模后，D、E組以蒸餾水灌胃，A、B、C組分別以0.1 mg/kg安定、0.2 mg/kg安定、3.6 mg/kg鹽酸氟西汀灌胃，1次/d，連續4周。

1.4小鼠絕望樣行為評價

1.4.1強迫游泳實驗強迫游泳實驗參考文獻[2]。在2 000 mL的玻璃燒杯中，加入25 ℃左右10 cm深的水，然后分別放入各組實驗小鼠。保持C57BL/6N小鼠在燒杯中游泳6 min，記錄小鼠在實驗中后4 min的不動時間。

1.4.2強迫懸尾實驗強迫懸尾實驗參考文獻[3]。強迫游泳結束24 h后，將小鼠懸掛于支架上，支架距桌面58 cm，膠帶粘貼位置為小鼠尾尖1 cm處。每只小鼠懸掛5 min，記錄實驗中小鼠不動時間(小鼠被動順從或完全不動)。

1.5海馬組織NF-L、SYP檢測方法采用Western blotting法。雙側海馬組織用1 mL的RIPA 緩沖液勻漿并取上清液。Qubit2.0測定蛋白含量。經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉PBST(含0.05%Tween-20的PBS液)37 ℃振蕩1 h封閉。封閉結束后，一抗4 ℃靜置孵育過夜，PBST漂洗3次，5 min/次。二抗室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，5 min/次，ECL發光試劑盒檢測信號，化學發光成像儀成像，以Image Lab5.0數據分析。

2　結果

2.1各組小鼠懸尾不動時間、游泳不動時間比較小鼠懸尾不動時間、游泳不動時間比較見表1。

表1　各組小鼠懸尾不動時間、游泳不動時間比較(s, ±s)

注：與E組比較，#P<0.01；與D組比較，△P<0.01，*P<0.05。

2.2各組小鼠海馬組織NF-L、SYP相對表達量比較小鼠海馬組織NF-L、SYP相對表達量比較見表2。

表2　各組小鼠海馬組織NF-L、SYP相對表達量比較

注：與E組比較，#P<0.01；與D組比較，△P<0.01，*P<0.05。

3　討論

皮質激素受體在人體分布廣泛，多種組織存在皮質激素受體，其中中樞神經系統中的皮質激素受體主要分布在海馬組織及邊緣系統，而該腦區與機體學習記憶、情緒緊密相關[4]。長期存在高皮質激素血癥或行為應激的效應，能夠對該腦區的正常功能甚至組織結構產生損傷作用，可導致海馬錐狀細胞萎縮及樹突回縮、數量減少[5]，減少海馬神經再生功能[6]和突觸形成等，進一步可致神經元細胞核的碎裂和溶解，最終使海馬組織萎縮功能障礙[7]。高皮質激素血癥在動物實驗中表現為體質量改變的同時還具有免疫抑制作用，長期高水平的血漿皮質激素可致免疫器官的減小和萎縮。

NF-L作為含量最為豐富的一種神經元骨架蛋白，是神經元細胞存活并發揮正常功能的物質基礎，其亞型與應激導致的神經元損傷關系最為密切[8]。SYP作為神經元突觸前膜的囊泡蛋白，其作用與突觸結構和功能可塑性調節密切相關，可反映突觸功能狀態[9]。NF-L、SYP的變化能夠對神經元組織結構和功能狀態作出判斷。

安定具有鎮靜、抗驚厥等作用，成人失眠、患病需鎮靜時常用此藥[10]。安定可以降低腎上腺皮質的激活程度下降，使應激狀態水平降低，從而使血漿中的皮質激素濃度降低，改善機體微循環和血流灌注，保護機體免受損傷；另有報道認為，服用安定后能夠調節神經系統內單胺類神經遞質，即上調腦內5-羥色胺；同時安定還能夠抑制中樞神經系統中興奮性氨基酸的毒性作用，抑制自由基合成保護神經元不受損傷[8]。本研究顯示，與E組比較，D組懸尾不動時間短，游泳不動時間長；與D組比較，A、B、C組懸尾不動時間長，游泳不動時間短。與E組比較，D組NF-L、SYP相對表達量降低；與D組比較，A、B、C組的NF-L、SYP相對表達量升高。提示安定可改善高皮質激素血癥小鼠絕望樣行為，其機制可能與上調NF-L、SYP表達有關。

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[6] Dranovsky A, Hen R. Hippocampal neurogenesis: regulation by stress and antidepressants[J]． Biol Psychiatry, 2006,59(12):1136-1143.

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國家中醫藥管理局重點學科溫病學建設項目(1022091002002)。

馬健(E-mail: majian67@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.010

R971

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1002-266X(2016)15-0034-02

2015-12-03)