ERK1/2信號轉導通路參與冠心病致心肌炎癥的機制

王菁，徐美林，暢昶，叢洪良△

ERK1/2信號轉導通路參與冠心病致心肌炎癥的機制

王菁1，徐美林1，暢昶2，叢洪良1△

目的 探討細胞外信號調節激酶（ERK）1/2信號轉導通路參與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┲滦募⊙装Y的機制。方法 45例尸檢病例分為3組：冠心病死亡組、冠心病組、對照組（每組15例）。HE染色和免疫組織化學染色白細胞共同抗原（CD45）并觀察心肌組織炎癥細胞浸潤情況；免疫組織化學染色和Western blot檢測心肌組織的總ERK 1/2（t-ERK1/2）和磷酸化ERK 1/2（p-ERK1/2）的蛋白表達及分布；熒光定量RT-PCR分析腫瘤壞死因子（TNF）-α表達水平；應用電泳遷移率轉變分析（EMSA）評價核因子（NF）-κB的活性。結果 與冠心病組、對照組比較，冠心病死亡組心肌炎癥細胞數、心肌組織p-ERK1/2蛋白表達、TNF-α mRNA表達及NF-κB活性明顯增高（均P＜0.05）。Western blot檢測冠心病死亡組p-ERK1/2和TNF-α mRNA、心肌炎細胞計數均呈正相關（r分別為0.675、0.893，均P＜0.01）。結論 ERK1/2信號轉導通路激活是冠心病致心肌炎癥反應的重要機制，抑制ERK1/2信號轉導通路可能成為冠心病防治的潛在新靶點。

絲裂原活化蛋白激酶1；冠狀動脈疾病；心肌；炎癥；腫瘤壞死因子α；NF-κB；細胞外信號調節激酶1/2

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）是目前心血管系統疾病中對生命健康危害最大的疾病，也是最常發生猝死的心血管系統疾病［1］。冠心病可致心肌炎癥反應，影響心功能，甚至導致患者死亡［2-3］。臨床醫生如果不能早期診斷、早期治療，將會失去寶貴的救治時機。細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）1/2是細胞分裂素活化蛋白激酶（MAPK）家族的一員。近年來的研究發現ERK1/2信號通路可能在心肌缺血中發揮保護作用，且證據表明ERK1/2信號通路參與了炎癥反應的調節機制［4］。本研究通過尸體解剖診斷有冠狀動脈粥樣硬化病變的患者的心肌組織，探討ERK1/2信號轉導通路參與冠心病致心肌炎癥反應的機制，以期為心肌炎癥反應及心功能損傷的發病機制研究及防治提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2002年1月—2012年12月天津市胸科醫院45例尸體解剖者的臨床及尸體解剖病理分析資料，其中男27例，女18例，年齡8～80歲，平均（47.16±16.33）歲。根據主要死因和心臟疾病情況分為3組：冠心病死亡組（患者的主要死因為冠心?。⒐谛牟〗M（患者的次要病變為冠心病）、對照組（患者沒有冠心?。?，每組15例。對45例尸體解剖患者的心肌組織進行研究。

1.2 主要試劑與儀器 （1）主要試劑。一抗：磷酸化ERK1/2 （p-ERK1/2，thr202/thr204，兔抗人，單克?。?、總ERK1/2抗體（t-ERK1/2，兔抗人，單克?。⒑艘蜃樱∟F）-κB（P65，兔IgG，單克?。┚徸訡ell signaling technology公司（Beverly MA，美國）；CD45抗體（鼠抗人）購自邁新生物技術開發有限公司（福州）；β-actin（鼠抗人）購自Sigma公司（美國）。二抗：HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自博奧森生物技術有限公司（北京）；山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購自邁新生物技術開發有限公司（福州）。QIAGEN RNeasy FFPE Kit購自Qiagen公司（德國）。RT-PCR的正反向引物、探針、Taq酶、dNTP購自天根生化科技有限公司（北京）。電泳遷移率轉變分析（EMSA）試劑盒購自Pierce公司（Rockford，IL，美國）。EMSA的探針序列購自生工生物技術有限公司（上海）。（2）主要儀器。Nanodrop微量分光光度計（Thermo，美國），PCR儀（Biometra，德國），Mx3000P熒光定量 PCR儀（Stratagene，美國），Quantity One分析軟件（BIO-RAD，美國），低溫高速離心機（Sigma，德國），5415D型高速離心機（Eppendorf，德國），DYY-BC型電泳儀（北京市六一儀器廠），H5-瓊脂糖小號電泳槽（上海市精益有機玻璃制品加工廠），凝膠掃描及圖像分析系統（PharmaciaBiotech，德國），脫水機（Leica，德國），生物組織包埋機（天津市久圣醫療電子儀器有限公司），RM2255全自動切片機（Leica，德國），恒溫水浴鍋（江蘇金壇市大中儀器廠），BX50F4光學顯微鏡（Olympus，日本），HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統（武漢千屏影象技術有限責任公司）。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 取經10%中性福爾馬林固定的心臟標本石蠟包埋，沿左室長軸以4 μm厚度連續切片，每份標本隨機取5個切片行HE染色，光鏡下觀察心肌的炎癥反應。

1.3.2 免疫組織化學染色分析CD45、t-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達 石蠟切片用二甲苯脫蠟后，置于3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶。CD45染色用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）進行高壓加熱修復；t-ERK1/2、p-ERK1/2染色用EDTA （pH 9.0）微波修復抗原（中火10 min，高火5 min）。CD45為即用型抗體，t-ERK1/2和p-ERK1/2抗體均按1∶100稀釋。一抗滴加于玻片上，置于濕盒內37℃1 h孵育。陰性對照則未用一抗。PBS沖洗后滴加生物素標志二抗，37℃孵育20 min，PBS沖洗后DAB顯色。蘇木精復染，中性樹膠封片。陽性結果為黃色或棕黃色。用病理圖像分析儀對每張切片隨機取5個視野（400倍，總面積約1 mm2）計數陽性表達的炎細胞，即該張切片的單位面積（1 mm2）炎細胞數等于5個視野炎細胞數的總和。CD45細胞膜著色，在所有炎細胞上都有陽性表達，用于計數炎細胞總數。p-ERK1/2細胞核著色，t-ERK1/2細胞漿著色，分別計數p-ERK1/2和t-ERK1/2陽性表達的炎細胞數目，二者的比值作為ERK1/2磷酸化水平。

1.3.3 熒光定量RT-PCR檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α表達 使用Qiagen RNeasy FFPE Kit提取45例人心肌組織蠟塊樣本的RNA。使用Nanodrop微量分光光度計對RNA的濃度進行檢測。45例樣本核酸濃度范圍為114.9～400.1 mg/L。根據RNA濃度將100 mg/L以上的RNA樣本稀釋至100 mg/L。使用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄。反轉錄反應體系中含5 μL RNA，25 mg/L polydT，1 μL（200 U）反轉錄酶。反應程序為70℃5 min，25℃10 min，37℃60 min（使用Biometra PCR儀進行反轉錄）。TNF-α基因引物：上游5′-GGCGTG?GAGCTGAGAGAT-3′，下游5′-AAGAGGACCTGGGAGTAG?AT-3′，探針5′-ACCAGCTGGTGGTGCCATCAG-3′（5′端以FAM修飾，3′端以BHQ修飾）；β-actin引物：上游5′-GAT?CATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游 5′-ACTCCTGCTTGCT?GATCCAC-3′，探針5′-CTCGCTGTCCACCTTCCAGCAGAT-3′（5′端以FAM修飾，3′端以BHQ修飾）。每種熒光定量PCR反應體系中含3 μL cDNA模板，正反向引物、探針各0.3 μmol/L，Taq酶（1 U）、dNTP（0.2 mmol/L）。反應程序為95℃10 min；95℃15 s，60℃60 s，40個循環。使用Strata?gene Mx3000P熒光定量PCR儀，于60℃采集熒光。使用2-△Ct法計算TNF-α相對于β-actin的表達量。

1.3.4 Western blot分析ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達 稱取新鮮心肌組織70 mg，剪碎后，放入500 μL裂解液勻漿，在4℃下以12 000 r/min離心15 min提取心肌組織總蛋白；每份標本取蛋白液25 μL上樣蛋白于10%分離膠和5%濃縮膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白轉移至PVDF膜；室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入封閉液稀釋的一抗（t-ERK1/2，1∶1 000；p-ERK1/2，1∶1 000；β-actin，1∶8 000），放置在37℃恒溫箱中2.5 h。加入Western洗滌液（P0023C），在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min，共洗滌3次。然后加入稀釋的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶4 000），室溫震蕩2 h。放射自顯影后，制成膠片。應用凝膠圖像分析系統分析吸光度（A）值，t-ERK1/2校正，以 p-ERK1/2與 t-ERK1/2的比值反映ERK1/2磷酸化水平。

1.3.5 EMSA評價NF-κB（P65）活性 根據核蛋白提取試劑盒說明提取心肌核蛋白，核蛋白與探針室溫下孵育20 min，上樣于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。NF-κB寡核苷酸探針序列：5′-AGTTGAGGGACTTTCCCAGGC-3′，3′-TCAACTCCCTGAAAGGGTCCG-5′（上海生工生物技術有限公司）；非特異性未標記SP1寡核苷酸探針序列：5′-ATTC?GATCGGGGCGGGGCGAGC-3′，3′-TAAGCTAGCCCCGCCCC?GCCCCGCTCG-5′（上海生工生物技術有限公司）。陰性對照實驗僅含有生物素標記探針未加入核蛋白，兩組競爭對照實驗，一組是除含有生物素標記探針和核蛋白外另加入100倍的未標記探針參與競爭核蛋白的結合，另一組是加入非特異性未標記SP1寡核苷酸探針。反應產物經6.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳。放射自顯影后，制成膠片。凝膠圖像分析系統分析A值，反映NF-κB的活化程度。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件對數據進行分析處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗，相關分析采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較 3組性別差異無統計學意義，年齡差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of gender and age between three groups表1 3組患者的性別、年齡比較 （n=15）

2.2 HE染色結果 （1）冠心病死亡組。包括急性心肌梗死8例（伴陳舊性梗死3例）；再發急性心肌梗死5例；心肌梗死區心臟破裂，引發心包填塞1例；冠狀動脈痙攣1例。梗死部位主要在左心室前壁、心尖部和室間隔。①急性心肌梗死：壞死灶邊緣中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。②不同部位的陳舊性心肌梗死：部分心肌間見小灶狀以淋巴、單核細胞為主的炎癥細胞浸潤。③同一部位的依次急性心肌梗死發作：部分壞死灶以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。部分心肌間見小灶狀淋巴、單核細胞浸潤。④心肌梗死區心臟破裂，引發心包填塞：壞死溶解的心肌間見中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。⑤冠狀動脈痙攣：部分斷裂心肌纖維間見少量中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤。（2）冠心病組。部分心肌間以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤；部分心肌間見以淋巴、單核細胞為主的炎癥細胞浸潤。（3）對照組。心肌間見少量以淋巴、單核細胞為主的炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.3 心肌炎癥細胞計數比較 免疫組化染色（CD45）觀察心肌炎癥細胞計數結果顯示，冠心病死亡組炎癥細胞數明顯多于冠心病組和對照組（P＜0.05），冠心病組炎癥細胞數多于對照組（P＜0.05），見表2、圖2。

2.4 熒光定量RT-PCR結果 冠心病死亡組TNF-α相對表達量明顯高于冠心病組和對照組（P＜0.05），冠心病組TNF-α相對表達量高于對照組（P＜0.05），見表2。

2.5 Western blot檢測p-ERK1/2表達水平 冠心病死亡組p-ERK1/2水平明顯高于冠心病組和對照組（P＜0.05），冠心病組p-ERK1/2表達水平高于對照組（P＜0.05），見表2、圖3。

2.6 免疫組化分析p-ERK1/2水平 冠心病死亡組p-ERK1/2水平明顯高于冠心病組和對照組（P＜0.05），見表2，圖4、5。

2.7 EMSA檢測結果 冠心病死亡組NF-κB的活性明顯高于冠心病組和對照組（P＜0.05），冠心病組NF-κB的活性高于對照組（P＜0.05），見表2、圖6。

Tab.2 Comparison of myocardial inflammatory cell counts，TNF-α，the phosphorylation of ERK1/2 and NF-κB between three groups表23組患者的心肌炎癥細胞計數、TNF-α、p-ERK1/2和NF-κB結果比較 （n=15）

Fig.3 Western blot analysis of p-ERK1/2 and t-ERK1/2圖3 Western blot定量分析ERK1/2磷酸化水平

2.8 相關性分析 Western blot檢測冠心病死亡組p-ERK1/2和TNF-α mRNA、心肌炎癥細胞計數均呈正相關（r分別為0.675、0.893，均P＜0.01）。

Fig.6 Expressions of NF-κB in three groups（EMSA）圖6 各組NF-κB表達結果（EMSA）

3 討論

本研究結果表明活化的ERK1/2信號通路在冠心病致心肌炎癥反應中發揮了重要作用。隨著冠心病導致心肌損害情況加重，伴隨的心肌炎癥反應也更加嚴重。免疫組化定位分析顯示，t-ERK1/2在炎癥細胞的胞漿著色，p-ERK1/2在炎癥細胞的胞核著色，證實ERK1/2主要被磷酸化而激活，由胞質進入細胞核。冠狀動脈粥樣硬化可激活心肌細胞的ERK1/2磷酸化，并伴隨明顯的心肌炎癥反應，即NF-κB結合活性顯著升高，TNF-α mRNA表達增加以及浸潤心肌組織的炎癥細胞數目增多。

在局部炎癥反應中，ERK1/2信號通路的激活始于轉膜和活化Raft，后者磷酸化激活ERK1/2［4-6］。ERK是一種MAPK，可將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，介導細胞生物化學反應，如凋亡、增殖、轉化等。國內外研究表明，p-ERK1/2能調控細胞的凋亡、增殖活動，并且對心肌細胞有明顯保護作用［7-9］。p-ERK1/2由胞質進入細胞核作用于NF-κB、Elk-1、ATF等轉錄因子，轉錄因子進一步調節各自靶基因的轉錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，參與細胞增殖與分化等多種生物學反應［10］。NF-κB是調節各種炎癥細胞因子以及炎癥介質的主要轉錄因子，激活NF-κB可引起炎癥級聯放大效應，是調節促炎癥細胞因子TNF-α最重要的核轉錄因子之一［11］。TNF-α在多種組織細胞均誘導激活ERK1/2［12］。有動物實驗研究顯示靜脈使用 ERK1/2抑制劑PD98059可抑制ERK1/2磷酸化，而且降低心肌組織NF-κB的結合活性、抑制TNF-α mRNA的表達；PD98059可明顯減少心肌組織炎癥細胞的浸潤［4-5］。TNF-α等細胞因子受體是酶偶聯受體，當與配體結合后活化Ras蛋白，Ras偶聯多種酶系反應促炎介質的釋放和細胞增殖等，Ras經過Ras-Raf-1-ERK1/2途徑激活ERK，因此ERK1/2通過活化NF-κB促進炎癥細胞因子TNF-α的轉錄，后者又激活ERK1/2，從而形成一個循環，觸發放大炎癥反應［4，13-15］。

綜上所述，活化的ERK1/2信號通路在冠心病致心肌炎癥反應及心功能損傷過程中發揮了重要作用，“ERK1/2→NF-κB→TNF-α”級聯反應的明確，提示抑制ERK1/2信號轉導通路可能成為冠心病致心肌炎癥反應防治的潛在新靶點。

（圖1、2、4、5見插頁）

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（2015-10-28收稿 2016-02-22修回）

（本文編輯 李國琪）

Mechanisms of ERK1/2 signaling pathway participate in inflammatory reaction caused by coronary heart disease

WANG Jing1，XU Meilin1，CHANG Chang2，CONG Hongliang1△
1 Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300222，China；2 the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology
△

Objective To investigate the effects of ERK1/2 signaling pathway on coronary atherosclerosis-associated inflammatory reaction in autopsy cases.Methods Forty-five autopsy cases were divided into three groups:coronary arterydisease（CHD）-associated death group，CHD group and control group（n=15 for each group）.The inflammatory cell infiltration in myocardial tissues was observed through staining leucocyte common antigen（CD45）by HE and immunohistochemistry method.The protein expression level and distribution in extracellular signal-regulated kinase1/2（t-ERK1/2）and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2（p-ERK1/2）of myocardial tissues were detected by immunohistochemistry and Western-blot assay.The expression level of tumor necrosis factor α（TNF-α）was determined using semiquantitative RT-PCR analysis.The activity of nuclear factor（NF）-κB was assessed using electrophoretic mobility shift assay（EMSA）.Results Compared with CHD and control groups，myocardial inflammatory cell counts，phosphorylation of ERK1/2，TNF-α mRNA expression and NF-κB activation were significantly increased in CHD-associated death group（P＜0.05）.Western blot analysis showed that the phosphorylation of ERK1/2 was positively correlated with expression of TNF-α mRNA and the number of inflammatory cells in CHD-associated death group（r=0.675，P＜0.01；r=0.893，P＜0.01）.Conclusion Results reveal that the activation of ERK1/2 signaling pathway is considered as an important mechanism for coronary atherosclerosis caused myocardial inflammatory reaction，which indicates that the inhibition of ERK1/2 signal transduction pathway may become a potential new target for prevention and treatment of atherosclerotic coronary infarction.

mitogen-activated protein kinase 1；coronary artery disease；myocardium；inflammation；tumor necrosis factor-alpha；NF-kappa B；extracellular signal-regulated kinases 1/2

R365

A

10.11958/20150269

天津市衛生局科技基金（2011KZ59）

1天津市胸科醫院（郵編300222）；2河南科技大學第一附屬醫院

王菁（1975），女，副主任醫師，碩士，主要從事心血管系統病理研究

△通訊作者 E-mail:hongliangcong@126.com