自發(fā)性糖尿病GK大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變模型的建立

富曉旭，馮露琳，張翕宇，胡蕓，南小亞，謝春光，杜聯(lián)

實(shí)驗(yàn)研究

自發(fā)性糖尿病GK大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變模型的建立

富曉旭1，馮露琳1，張翕宇1，胡蕓2，南小亞1，謝春光1，杜聯(lián)3△

目的 通過高脂飼養(yǎng)GK大鼠建立一種符合人類糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）發(fā)病特點(diǎn)，又操作簡單的DPN大鼠模型。方法 7～8周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠30只，喂養(yǎng)高脂飼料造模。另取30只SPF級(jí)正常Wistar大鼠作為正常組，喂養(yǎng)普通飼料。每周監(jiān)測動(dòng)物血糖、體質(zhì)量、飲水量、飼料量。分別于干預(yù)8周、12周、16周后檢測血清糖化血紅蛋白、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，取對(duì)側(cè)坐骨神經(jīng)做HE染色，TUNEL染色計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 隨著造模時(shí)間延長，GK大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、生長遲緩等表現(xiàn)。與正常組相比，造模12周及16周的大鼠血糖、糖化血紅蛋白升高（P＜0.01），感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低（P＜0.01），運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度有一定下降趨勢（12周P＜0.05，16周P＞0.05），坐骨神經(jīng)病理形態(tài)及雪旺細(xì)胞凋亡情況均提示DPN的形成，并與正常大鼠形成鮮明對(duì)照（凋亡指數(shù)P＜0.01）。結(jié)論 長期高脂飼料喂養(yǎng)的GK大鼠是DPN研究的良好模型，12周是較為成熟且經(jīng)濟(jì)的造模時(shí)間。

糖尿病神經(jīng)病變；疾病模型，動(dòng)物；GK大鼠

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致殘甚至致死的主要原因之一，嚴(yán)重地影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。越來越多的有關(guān)DPN病理、生理的大鼠實(shí)驗(yàn)研究得到開展和報(bào)道，但實(shí)驗(yàn)所使用的大鼠卻沒有公認(rèn)的、主流的造模方法。本研究旨在通過高脂飼養(yǎng)GK大鼠，從而建立一種既符合人類DPN發(fā)病特點(diǎn)，又操作簡單的DPN大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠30只，SPF級(jí)、雄性、7～8周齡，購自中國科學(xué)院上海斯萊克（SLAC）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012－0002。Wistar大鼠30只，SPF級(jí)、雄性、7～8周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2013-24。（2）主要儀器與試劑。血糖儀（美國強(qiáng)生公司），滬食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2010第2400865號(hào)；石蠟切片機(jī)（德國Leica公司，2015型）；數(shù)碼顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪公司，PHY-Ⅲ型）；圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus 6.0型）；酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司，DENLEY DRAGON Wellscan MK3型）；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司，BL420型）。濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋公司，批號(hào)：K135925C）；TUNEL試劑盒（瑞士羅氏公司，批號(hào)：14590300）；大鼠糖化血紅蛋白（HbA1c）檢測試劑盒（上海西唐公司，貨號(hào)：F15631）。

1.2 方法

1.2.1 造模 GK大鼠作為模型組予以高脂飼料喂養(yǎng)造模，Wistar大鼠作為正常組予以普通飼料喂養(yǎng)，動(dòng)物飼料均購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)屏障系統(tǒng)大鼠實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)，室溫（22±2）℃，空氣流通，相對(duì)濕度59%～61%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。自動(dòng)物飼養(yǎng)開始，每日觀察動(dòng)物一般情況，每周三于禁食8 h后逐一稱量體質(zhì)量，并測量小鼠尾靜脈血糖水平。干預(yù)8周、12周、16周后于2組中分別隨機(jī)抽取10只動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測 采用BL420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測。待動(dòng)物完全麻醉后，俯臥固定，剖開股二頭肌與半膜肌之間的皮膚，并沿兩肌之間行鈍性分離，暴露分離右側(cè)坐骨神經(jīng)，剝離過程中蘸取液體石蠟保護(hù)神經(jīng)，切斷腓總神經(jīng)，以防止容積導(dǎo)電干擾。分別于坐骨神經(jīng)近心端和遠(yuǎn)心端放置2個(gè)特制的鉤狀電極，近心端為刺激電極，遠(yuǎn)心端為記錄電極，通過BL420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定系統(tǒng)刺激器給近心端電極施加刺激信號(hào)，記錄儀將記錄刺激信號(hào)所誘發(fā)的神經(jīng)誘發(fā)電位從近心端傳導(dǎo)至遠(yuǎn)心端電極所需時(shí)間，重復(fù)電刺激共3次，每次間隔1 min，取平均值記為t。將動(dòng)物后足以自然狀態(tài)與脊柱成45°。夾角向斜后方拉直，沿坐骨神經(jīng)經(jīng)過部位和方向，在動(dòng)物體表以彎角規(guī)準(zhǔn)確測定兩極間的距離s。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNVC）=s/t。對(duì)換兩個(gè)電極，同樣方法測感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV）。

1.2.3 坐骨神經(jīng)HE染色 分離左側(cè)坐骨神經(jīng)，取近心端約1 cm長的坐骨神經(jīng)投入4%甲醛固定液中固定。脫水前用自來水沖洗過夜，全自動(dòng)脫水機(jī)各級(jí)乙醇脫水、TO透明液透明、兩次浸蠟；包埋機(jī)常規(guī)石蠟包埋；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片5 μm；HE染色；切片以TO透明液透明，加拿大樹膠封片供鏡檢。以上標(biāo)本均按病理檢驗(yàn)SOP程序進(jìn)行，部分標(biāo)本照像并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 雪旺細(xì)胞凋亡檢測 切片常規(guī)脫蠟至水；胰蛋白酶處理組織；加TUNEL反應(yīng)混合液，37℃，避光孵育60 min；PBS漂洗3次；滴加DAPI復(fù)染，避光孵育5 min；PBS漂洗3次；緩沖甘油封片，4℃冰箱避光暫存。熒光顯微鏡下觀察拍照、讀片，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核顯示綠色熒光，復(fù)染DAPI的所有細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)色。在400倍鏡下隨機(jī)讀取2個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.5 ELISA法檢測HbA1c 按大鼠HbA1c檢測試劑盒說明書逐步操作，主要步驟包括加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品（大鼠血清），加入抗體，沖洗，加緩沖液和終止液，490 nm酶標(biāo)儀檢測HbA1c。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料根據(jù)數(shù)據(jù)的具體分布情況用±s或M（P25，P75）描述。除凋亡指數(shù)外，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；凋亡指數(shù)組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠一般情況比較 兩種類大鼠干預(yù)前體質(zhì)量差異較大，隨干預(yù)時(shí)間的延長，差異逐漸縮小，至12周開始差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周及以前，2組大鼠進(jìn)食量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，自12周起，模型組進(jìn)食量顯著高于正常組（P＜0.01）。模型組大鼠的飲水量則從飼養(yǎng)之初開始，除4周外，始終高于正常組（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of body mass，food intake and water intake at different time points between two groups表1 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及飲水量比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of body mass，food intake and water intake at different time points between two groups表1 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及飲水量比較（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組模型組t體質(zhì)量（g）4周8周0周105.5±4.7 260.9±14.9 31.435＊＊274.0±22.7 352.4±18.1 8.543＊＊370.9±26.7 398.7±22.9 2.500＊12周428.6±26.8 420.1±30.6 0.645 16周441.4±39.5 417.6±16.3 1.710組別正常組模型組t進(jìn)食量（g/d）0周17.9±1.3 18.6±1.6 0.634 4周8周20.9±1.2 19.3±0.6 1.961 23.4±0.7 25.6±3.6 1.060 12周20.5±2.2 28.4±1.5 5.164＊＊16周23.0±0.9 33.7±1.1 12.894＊＊組別正常組模型組t飲水量（mL/d）0周22±2 52±3 6.190＊＊4周8周70±11 59±3 1.770 63±8 117±12 11.163＊＊12周75±10 122±13 6.415＊＊16周80±9 129±14 6.190＊＊

2.2 2組大鼠血糖及HbA1c水平的比較 隨著干預(yù)時(shí)間的延長，模型組血糖呈逐漸升高的趨勢，至第12周趨于平穩(wěn)；而正常組血糖始終處于正常水平。8周、12周、16周2組HbA1c變化與血糖水平的變化相一致，見表2。

2.3 2組大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較 隨著造模時(shí)間延長，模型組大鼠SNCV呈逐步下降趨勢，且明顯低于正常組（P＜0.01）；MNCV速度下降不明顯，與正常組比較，其下降幅度也較SNCV為弱，僅12周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

Tab.2 Comparison of FPG and HbA1c at different time points between two groups表2 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠空腹血糖、HbA1c比較（n=10±s）

Tab.2 Comparison of FPG and HbA1c at different time points between two groups表2 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠空腹血糖、HbA1c比較（n=10±s）

＊＊P＜0.01

組別正常組模型組t空腹血糖（mmol/L）0周5.21±1.32 9.36±2.16 5.191＊＊4周8周5.28±0.81 12.98±5.16 4.659＊＊4.78±0.63 17.03±7.53 5.124＊＊12周4.42±0.33 21.62±8.89 6.304＊＊16周5.70±1.06 22.56±3.53 12.272＊＊組別正常組模型組t HbA1c（%）16周5.70±1.06 22.56±3.53 8.029＊＊8周4.78±0.63 17.03±7.53 4.032＊＊12周4.42±0.33 21.62±8.89 5.971＊＊

Tab.3 Comparison of nerve conduction velocity at different time points between two groups表3 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較（n=10，m/s，±s）

Tab.3 Comparison of nerve conduction velocity at different time points between two groups表3 各時(shí)間點(diǎn)2組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較（n=10，m/s，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別正常組模型組t SNCV 8周43.83±5.99 29.73±9.10 3.728＊＊12周46.48±16.04 24.11±4.49 3.581＊＊16周42.11±12.19 15.09±6.32 5.765＊＊組別正常組模型組t MNCV 8周12.50±2.93 9.78±4.54 1.326 12周12.39±3.95 8.67±2.26 2.381＊16周11.75±3.15 9.48±4.34 1.164

2.4 2組大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)觀察 正常組8周、12周、16周切片可見神經(jīng)束膜連續(xù)完整，神經(jīng)纖維細(xì)胞核清晰，纖維呈束狀，部分切面可見其交織成網(wǎng)狀，神經(jīng)纖維束連續(xù)，其間微血管較豐富。模型組8周切片可見部分神經(jīng)束膜破損及神經(jīng)束斷裂；12周神經(jīng)束膜均破損、不完整，神經(jīng)纖維細(xì)胞核固縮，神經(jīng)纖維束斷裂，溶解嚴(yán)重，發(fā)生液化性壞死，其間微血管少見，管腔較大，可見巨噬細(xì)胞；16周神經(jīng)纖維完整程度與12周基本相當(dāng)，見圖1。

2.5 2組大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞凋亡情況 正常組切片于熒光顯微鏡下幾乎未見凋亡細(xì)胞，模型組12周與16周切片均可見呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細(xì)胞核，見圖2。模型組凋亡指數(shù)明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而模型組12周與16周凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

Tab.4 Comparison of apoptosis index of Schwann cells between two groups表4 2組大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞凋亡指數(shù)比較［n=5，%，M（P25，P75）］

3 討論

DPN一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題，近年圍繞DPN開展了大量研究工作。在大鼠實(shí)驗(yàn)中，DPN的造模方法大多依賴鏈脲佐菌素（STZ）破壞胰島β細(xì)胞，即便是小劑量分次給藥，也難以模擬人類2型糖尿病發(fā)展為DPN的過程，且成模率與死亡率之間成正比，令研究者難以把握使用劑量，至今未產(chǎn)生公認(rèn)的造模方法。

由于疾病的隱匿性和檢測手段的差異，報(bào)道的DPN發(fā)病率范圍很大，為13%～75%不等［1］，但逐年上升的趨勢十分明顯［2-3］。目前有關(guān)DPN病理、生理的大鼠實(shí)驗(yàn)大多采用STZ腹腔注射Wistar或SD大鼠，或配合高脂飲食或配合動(dòng)脈鉗夾等方式。此類方法的成模時(shí)間極不穩(wěn)定，4～16周皆有報(bào)道［4-7］，且僅以血糖作為篩選模型的方式，更增加了模型的不穩(wěn)定性。

GK大鼠是一種自發(fā)性2型糖尿病模型，具有血糖輕度升高、葡萄糖刺激的胰島素分泌能力受損、胰腺β細(xì)胞團(tuán)塊量減少等特點(diǎn)，且長期患病后，易發(fā)生各種并發(fā)癥［8-9］。其嚴(yán)格的篩選方式和漫長的繁育時(shí)間決定了GK大鼠穩(wěn)定的生物學(xué)特性、較高的存活率及類似于人類2型糖尿病的血糖水平與胰島素分泌的特點(diǎn)，已逐漸在國內(nèi)外糖尿病實(shí)驗(yàn)研究中得到越來越多的應(yīng)用。筆者以往的研究利用高脂飼料成功建立自發(fā)性糖尿病大血管病變小鼠模型［10］。本研究證實(shí)，長期高脂飼料喂養(yǎng)的自發(fā)性糖尿病大鼠亦可以作為DPN研究的良好模型，12周是較為成熟且經(jīng)濟(jì)的造模時(shí)間；模型動(dòng)物的血糖、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、坐骨神經(jīng)病理形態(tài)及雪旺細(xì)胞凋亡情況均與正常大鼠形成鮮明對(duì)照，且狀態(tài)穩(wěn)定。長期高脂飼料喂養(yǎng)的GK大鼠是一種符合人類DPN發(fā)病特點(diǎn)，又操作簡單的DPN大鼠模型。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著造模時(shí)間的延長，GK大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、生長遲緩、活動(dòng)量減少、大便黏滯、小便黃臭等表現(xiàn)，與中醫(yī)學(xué)氣陰兩虛、痰濁阻滯的病證特點(diǎn)類似。自發(fā)性糖尿病大鼠為遺傳缺陷動(dòng)物，又屬于中醫(yī)學(xué)先天稟賦不足的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，先天稟賦不足，腎精虧虛為糖尿病最主要的病理因素，隨著病程進(jìn)展，陰損及氣，氣陰兩虛是糖尿病多種并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)［11］。本實(shí)驗(yàn)造模采用的高脂飼料由豬油、膽固醇、豬膽鹽等“膏粱厚味”之品配比而成，不僅釀生痰濁，其滋膩之性又可礙脾傷胃，使氣血生化乏源，加重氣陰兩虛的程度，形成“氣陰兩虛、痰濁阻滯”之證［12］。該證又與中醫(yī)學(xué)對(duì)DPN的認(rèn)識(shí)相符合［13］。因此，該造模方法既模擬了DPN自然發(fā)病的過程，又大大縮短了這一進(jìn)程的時(shí)間，普遍適用于DPN的藥效、藥理學(xué)研究，尤其對(duì)中醫(yī)藥治療氣陰兩虛、痰濁阻滯型DPN的研究具有針對(duì)性。

由于本研究造模過程中未加入任何直接損傷周圍神經(jīng)的造模因素，該模型的雪旺細(xì)胞凋亡情況不甚明顯。模型組切片在熒光顯微鏡下，并非每個(gè)視野內(nèi)都能見到凋亡細(xì)胞核，僅在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后得出較正常組凋亡程度高的結(jié)論。因而，在雪旺細(xì)胞凋亡相關(guān)的DPN研究中，不建議采用該模型。

（圖1、2見插頁）

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（2015-10-13收稿 2016-03-14修回）

（本文編輯 李國琪）

The establishment of diabetic peripheral neuropathy model in spontaneous diabetic GK rats

FU Xiaoxu1，F(xiàn)eng Lulin1，ZHANG Xiyu1，HU Yun2，NAN Xiaoya1，XIE Chunguang1，DU Lian3△
1 Clinical Medicine College of Chengdu University of TCM，Chengdu 610072，China；2 Department of Endocrinology，Chongqing TCM Hospital；3 Basic Medical College of Chengdu University of TCM△

Objective To establish a simple diabetic peripheral neuropathy（DPN）rat model with the high fat-fed in GK rats.Methods A total of 30 GK rats（7-8 weeks）were fed with high-fat diet to establish the DPN model.Thirty normal Wistar rats were fed with ordinary diet（control group）.The blood-sugar value，body mass，water-intake and food-intake were monitored every week in two groups.The serum level of glycosylated hemoglobin，the right sciatic nerve conduction velocity were detected at 8，12 and 16 weeks respectively.The left sciatic nerve was used for HE and TUNEL staining. Results The manifestations of polydipsia，polyphagia and growth retardation were gradually appeared in GK rats.After 12 and 16 weeks，the blood-sugar and glycosylated hemoglobin were significantly increased in GK rats compared with those of normal Wistar rats（P＜0.01）.The sensory nerve conduction velocity decreased obviously（P＜0.01）.And motor nerve conduction velocity showed a certain decline trend（12 week P＜0.05，16 week P＞0.05）.The sciatic nerve pathological features and Schwann cell apoptosis suggested that the model of DPN was successfully established（apoptosis index，P＜0.01）.Conclusion GK rats fed by high-fat diet are the satisfactory models of the DPN in experimental research.And 12-week is a suitable and economical time for molding.

diabetic neuropathies；disease models，animal；Goto-Kakizaki rats

R587.25

A

10.11958/20150225

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373783）

1成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（郵編610072）；2重慶市中醫(yī)院內(nèi)分泌科；3成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

富曉旭（1988），女，博士在讀，主要從事中醫(yī)藥防治內(nèi)分泌及代謝性疾病的實(shí)驗(yàn)研究

△通訊作者 E-mail:1325537604@qq.com