IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質瘤中表達的研究

王雷，劉艷波，王振江，趙信理，沈維高△

IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質瘤中表達的研究

王雷1，劉艷波2，王振江3，趙信理1，沈維高1△

目的 研究白細胞介素（IL）-17A及其受體（IL-17RA）在不同惡性程度膠質瘤中表達的差異。方法 收集膠質瘤患者50例，按照世界衛生組織的分類系統分為Ⅰ級12例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例，Ⅳ級7例。取患者外周血以及膠質瘤組織，熒光實時定量PCR檢測IL-17A及IL-17RA的mRNA水平，采用免疫組化和Western blot檢測IL-17A及IL-17RA的蛋白表達水平。結果 免疫組化染色結果顯示，隨著膠質瘤惡性程度增加，IL-17A及其受體IL-17RA表達增加。外周血中，IL-17A及其受體IL-17RA的mRNA水平隨著膠質瘤惡性程度增加而上升（F分別為8.96、10.34，均P＜0.05）。膠質瘤組織中IL-17A及其受體IL-17RA的mRNA水平隨著膠質瘤惡性程度增加而上升（F分別為11.21、14.11，均P＜0.05）。在外周血和膠質瘤組織中，IL-17A及其受體IL-17RA的蛋白水平隨著膠質瘤惡性程度增加也上升（外周血F分別為9.90、11.80，均P＜0.05；膠質瘤組織F分別為8.15、14.46，均P＜0.05）。結論 IL-17A及其受體IL-17RA的表達與膠質瘤惡性程度呈正相關性。

神經膠質瘤；白細胞介素-17A；白細胞介素-17A受體

神經膠質瘤簡稱膠質瘤，約占所有顱內原發腫瘤的一半，是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤之一。該疾病具有臨床治療效果差、患者生存時間短、預后較差等特點，嚴重危害人類健康。根據世界衛生組織（WHO）的分類系統，將腦膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ4個等級，其中Ⅲ和Ⅳ級惡性程度很高，患者的平均存活時間僅為1年。

腫瘤除了由腫瘤細胞組成以外，還包括免疫細胞、細胞外基質、血管和細胞因子等，因此腫瘤微環境也是膠質瘤的重要成分。細胞因子在膠質瘤的復雜性和異質性中占有重要地位，參與腫瘤的各種行為，包括侵襲、增殖、遷移、血管生成和免疫細胞浸潤等過程［1-2］。Th17細胞以分泌白細胞介素-17（inter?leukin-17，IL-17）而得名，此外，其還分泌IL-17F、IL-21和IL-22等多種細胞因子［3］。IL-17具有多種免疫生物學作用，與多種免疫性疾病及腫瘤都有密切的關系。IL-17作為一把雙刃劍，具有加速腫瘤生長和抑制腫瘤發展的雙重作用［4-5］。IL-17可通過對血管內皮細胞起到趨化和遷移作用，上調和協同其他血管生成因子表達等促進腫瘤血管的快速生長［6］。有研究證實在膠質瘤組織中IL-17呈高表達［7］。也有些研究指出，Th17細胞在早期的腫瘤組織中比例明顯升高，但隨著疾病的進展，Th17細胞和IL-17A水平反而降低［8］。IL-17A及其受體（IL-17RA）的水平與膠質瘤惡性程度之間的關系尚不清楚。本研究通過檢測外周血和膠質瘤組織中的IL-17A和IL-17RA轉錄和翻譯水平，來研究IL-17A及其受體IL-17RA在不同惡性程度膠質瘤中的表達情況，以期為膠質瘤惡性程度的臨床診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 病例及分組 收集2013年3月—2015年3月吉林省北華大學附屬醫院、吉林大學第一臨床醫院、吉林市人民醫院神經外科手術切除的膠質瘤組織共50例。患者年齡35～50歲，平均（43±8）歲。按WHO2007中樞神經系統腫瘤分類標準進行分級，Ⅰ級12例：毛細胞型星形細胞瘤；Ⅱ級18例：彌漫型星形細胞瘤以及少突膠質細胞瘤；Ⅲ級13例：間變性少突膠質細胞瘤以及彌漫浸潤型星形細胞瘤；Ⅳ級7例：膠質肉瘤以及膠質母細胞瘤。收集正常組織10例，來自單純活檢患者，年齡40～50歲。

1.2 標本采集 術中收集膠質瘤組織后儲存于-80℃。患者術前1 d禁食12 h以上，采集空腹橈靜脈血5 mL，離心收集血清用于后續檢測。

1.3 免疫組化檢測IL-17A和IL-17RA的表達 用4%甲醛固定膠質瘤組織，進行石蠟包埋切片。切片脫蠟后，PBS+5% BSA室溫封閉30 min，洗3次。一抗使用IL-17A山羊抗人IgG和IL-17RA山羊抗人IgG。PBS洗3次，二抗使用生物素化的二抗液，室溫孵育30 min。PBS洗3次，在200倍鏡下進行觀察。褐色及棕黃色顆粒為陽性表達。視野下僅有清晰藍色，為正常；鮮有褐色為Ⅰ級；少量褐色為Ⅱ級；褐色及棕黃色顆粒較多為Ⅲ級；褐色及棕黃色顆粒尤為明顯為Ⅳ級。

1.4 實時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測外周血和膠質瘤組織中IL-17A和IL-17AR的mRNA水平 分別提取外周血和膠質瘤組織總RNA，并反轉錄成cDNA，具體方法參照文獻［9］。按照SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（TAKARA）說明書進行real-time PCR檢測。每個樣品設3個復孔。以GAPDH作為內參。引物序列如下，GAPDH-F：5′-ACCA?CAGTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH-R：5′-TCCACCACCCT?GTTGCTGTA-3′；IL-17A-F：5′-TGCCCCAACTCCTTCCG?GCT-3′；IL-17A-R：5′-GGGTTCCTGAGGGGCTGGGT-3′；IL-17RA-F：5′-GCTGCCTAAATGAC-3′；IL-17RA-R：5′-TGTGAGTAGCGGT-3′。基因的相對水平按照2-ΔΔCt方法進行計算。

1.5 Western blot檢測IL17-A和IL17-RA的蛋白水平 分別抽提外周血和膠質瘤組織中總蛋白。使用BCA方法確定每個樣品的蛋白濃度，從而保證蛋白電泳上樣時蛋白量一致。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，300 mA轉膜60 min。封閉液室溫封閉60 min，一抗4℃過夜，TBST溶液洗膜10 min，洗3次，二抗室溫60 min，最后TBST溶液洗膜10 min，洗3次，使用ECL發光采集信號。β-tublin作為內參。使用Image J灰度掃描對Western blot條帶進行量化分析。人IL17 A抗體以及人IL17 RA抗體均購自R&D公司。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0進行統計分析，所有計量資料均用±s表示，多組比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同級別膠質瘤組織中IL-17A和IL-17RA的表達 在腫瘤細胞的胞質中可見IL-17A和IL-17RA陽性表達，呈棕黃色顆粒，且隨著膠質瘤級別的增加，棕黃色染色區域增多，見圖1。相比于IL-17A，IL-17RA棕黃色更重。

2.2 不同級別膠質瘤患者外周血以及膠質瘤組織中IL-17A、IL-17RA mRNA水平比較 在正常健康人群中，外周血IL-17A、IL-17RA mRNA水平較低，隨著膠質瘤病理分級的增加，IL-17A、IL-17RA mRNA水平逐漸升高，見圖2。不同級別膠質瘤腦組織中的IL-17A、IL-17RA mRNA水平，也隨著病理分級的增加而呈增長趨勢，見圖3。

Fig.2 The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA in peripheral blood of patients with different grades of gliomas圖2 不同級別膠質瘤患者外周血中IL-17A、IL-17RA mRNA水平

Fig.3 The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA in different grades of glioma tissues圖3 不同級別膠質瘤組織中IL-17A、IL-17RA mRNA水平

2.3 不同級別膠質瘤患者外周血以及膠質瘤組織中IL-17A、IL-17RA蛋白水平比較 IL-17A、IL-17RA蛋白水平在外周血以及膠質瘤組織中均隨著膠質瘤病理分級的增加而增長，說明膠質瘤發生與發展能夠刺激機體分泌大量的IL-17A，并且其受體蛋白IL-17RA也相應增加，見圖4、5。

Fig.4 Protein levels of IL-17A and IL-17RA in peripheral blood of patients with different grades of gliomas圖4 不同級別膠質瘤患者外周血中IL-17A、IL-17RA蛋白水平

3 討論

目前，已有6個IL-17家族成員被發現，包括IL-17A（IL-17）、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（即IL-25）和IL-17F［10］。IL-17A是IL-17家族的原型，IL-17F與IL-17A有約50%的同源性。通常，IL-17家族成員以同源二聚體或異源二聚體的形式行使功能［11-12］。其中，IL-17A、IL-17E及IL-17F是重要的促炎癥因子。

Fig.5 Protein levels of IL-17A and IL-17RA in different grades of glioma tissues圖5 不同級別膠質瘤組織中IL-17A、IL-17RA蛋白水平

IL-17與多種疾病都是相關的，例如風濕性關節炎［13］、系統性紅斑狼瘡［14］、炎癥性腸病［15］、肝硬化［16］等。雖然，炎癥與腫瘤的關系備受關注，而IL-17這一促炎癥因子在腫瘤發生中的作用卻有爭議。一些研究認為，IL-17可誘導IL-6活化STAT3途徑，抗凋亡、促生長和促血管生成基因的表達，從而起到促進腫瘤生長的作用［17］。另一些研究則認為，IL-17可以誘導趨化因子，從而招募樹突細胞及殺傷性效應T細胞至腫瘤位置，間接起到抗腫瘤的作用。還有一些觀點認為，IL-17在腫瘤中的作用依賴于發病背景［18］。為了明確IL-17A與腫瘤之間的關系，本研究收集了50例臨床樣本，并將其按照惡性程度進行分類，以期明確IL-17的水平是否與膠質瘤的惡性程度相關，結果顯示，不論在患者的外周血還是膠質瘤組織中，IL-17A和IL-17RA的水平均隨著膠質瘤惡性程度增加而上升。

通常，人腦膠質細胞中IL-17的表達量很低，并且在腫瘤中IL-17是起促進或抑制作用主要依賴腫瘤的免疫原性［19］。IL-17在腦組織中含量少也可能因為其mRNA中富含AU重復序列，該序列容易被降解，導致最終的蛋白水平很低；此外，由于IL-17主要由血液中Th17細胞分泌，通過血-腦脊液屏障進入腦組織，因此IL-17在腦內的含量較低［20］。本研究結果顯示IL-17的表達量隨腫瘤的惡性程度的升高而增多，這一原因主要是惡性膠質瘤中有更多的Th17細胞浸潤。由Th17引起的慢性炎癥反應能夠增強腫瘤的代謝，導致腫瘤及其周圍組織缺氧，導致血管形成反應；同時，IL-17還會招募大量效應細胞殺傷腫瘤，因而腫瘤的惡性程度越高，缺氧越嚴重，Th17細胞浸潤越多，分泌的IL-17就越多［21-22］。

綜上，IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質瘤患者的膠質瘤組織和外周血中的表達有明顯差異，與膠質瘤病理分級呈正相關性，表明IL-17A及IL-17RA可能在膠質瘤發生、發展中起關鍵的作用。IL-17A和IL-17RA的表達可能會成為判斷膠質瘤惡性程度的參考指標，具有重要的臨床價值。

（圖1見插頁）

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（2015-11-01收稿 2016-01-30修回）

（本文編輯 閆娟）

A study on the expressions of IL-17A and IL-17RA in different degrees of malignant glioma

WANG Lei1，LIU Yanbo2，WANG Zhenjiang3，ZHAO Xinli1，SHEN Weigao1△
1 Department of Neurosurgery，Beihua University Affiliated Hospital，Jilin 132000，China；2 Department of Pathophysiology，3 Department of Anatomy，School of Basic Medical Sciences，Beihua University△

Objective To explore the expressions of interleukin（IL）-17A and its receptor IL-17RA in different degrees of malignant gliomas.Methods Fifty patients with glioma were collected in this study.Accordance to the World Health Organization Classification System，patients were classified by malignancy grade，including gradeⅠ（n=12），gradeⅡ（n=18），gradeⅢ（n=13）and gradeⅣ（n=7）.The glioma tissue and peripheral blood samples of patients were obtained for detecting the expression levels of IL-17A and IL-17RA mRNA by using immunohistochemistry，quantitative real-time PCR.Western blot assay was used to detect expressions of IL-17A and IL-17RA in both the macroscopic （immunohistochemistry）and molecular levels（mRNA and protein）. Results Immunohistochemical staining showed that the expression levels of IL-17A and its receptor IL-17RA increased with the increase of the malignant degree of gliomas. The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA receptors in peripheral blood were up-regulated with the increasing malignancy grade of glioma（F=8.96，P＜0.05；F=10.34，P＜0.05）.The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA in glioma tissues were up-regulated with the increasing malignancy grade of glioma（F=11.21，P＜0.05；F=14.11，P＜0.05）.The protein levels of IL-17A and IL-17RA in peripheral blood and glioma tissues were also up-regulated with the increasing malignancy grade of glioma（in peripheral blood:F=9.90，P＜0.05；F=11.80，P＜0.05；and in gliomas tissues:F=8.15，P＜0.05；F=14.46，P＜0.05）.Conclusion The expressions of IL-17A and IL-17RA receptor are positively correlated with malignancy grade of glioma.These results provide some reference for clinical diagnosis of malignant gliomas.

glioma；interleukin-17A；interleukin-17RA

R739.41

A

10.11958/20150260

吉林省衛生計生委課題（2014Q038）；吉林省衛生廳資助項目（2013Z043）

1吉林長春，北華大學附屬醫院神經外科（郵編132000）；2北華大學基礎醫學院病理生理教研室，3解剖教研室

王雷（1978），男，副主任醫師，博士，主要從事神經外科腫瘤研究

△通訊作者 E-mail：shenweigao@163.com