大鼠ASIC1基因啟動子熒光素酶報告質粒的構建及其功能鑒定

周仁鵬，吳小山，王志森，謝亞亞，李　悅，代貝貝，王志強，葛金芳，陳飛虎

大鼠ASIC1基因啟動子熒光素酶報告質粒的構建及其功能鑒定

周仁鵬，吳小山，王志森，謝亞亞，李悅，代貝貝，王志強，葛金芳，陳飛虎

目的 構建大鼠酸敏感離子通道1（ASIC1）基因啟動子熒光素酶報告質粒pGL3-ASIC1-promoter，并進行功能的鑒定。方法 設計、合成ASIC1啟動子引物，采用聚合酶鏈反應（PCR）技術從大鼠全基因組DNA中擴增出ASIC1啟動子片段；Nhe I和Xho I雙酶切后將目的片段連接到pGL3-Basic報告載體上；構建的pGL3-ASIC1-promoter重組質粒和pRLTK內參質粒瞬時共轉染293T細胞檢測ASIC1啟動子活性。結果 PCR擴增得到大鼠ASIC1基因啟動子片段；成功構建pGL3-ASIC1-promoter報告基因載體，菌落PCR和測序結果表明啟動子DNA序列正確。與空質粒pGL3-Basic轉染組相比，pGL3-ASIC1-promoter質粒轉染組的熒光素酶活性明顯增加（P＜0.01）。結論 成功構建了大鼠ASIC1基因啟動子報告基因載體，為探究ASIC1轉錄表達的調控機制奠定基礎。

ASIC1；啟動子；熒光素酶；報告基因

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.006.html

酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）是一類胞外H+激活的陽離子通道，屬于阿米洛利敏感的上皮鈉通道/退變素（epithelial Na+channels/degenerin，ENaC/DEG）超家族，廣泛地表達在中樞和外周神經系統以及非神經組織中，通過介導Na+和Ca2+內流參與各種病理生理效應［1］。ASIC1因其對Ca2+有通透性而有廣泛的生物學功能及重要的生理病理學意義［2］。ASIC1a在佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠關節軟骨細胞上有表達［3-4］，并參與關節軟骨的代謝過程［5］；阻斷ASIC1a可以降低酸誘導的AA大鼠關節軟骨細胞凋亡［6-7］。由此推測ASIC1可能在類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的發生和發展過程中發揮著重要作用。該研究通過構建大鼠ASIC1啟動子報告基因質粒，并觀察其轉錄調控活性，為探究其基因轉錄活性的調控機制以及為進一步探究ASIC1在RA中的作用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料 293T細胞株（本實驗室保存）；DMEM/ F-12培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌感受態細胞 DH5α、Taq酶和 dNTP、PrimeSTAR、6 ×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；1 000 bp DNA ladder Marker（美國Thermo Scientific公司）；細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（美國 Axygen公司）；限制性內切酶Nhe I和Xho I（美國NEB公司）；pGL3-Basic載體、內參質粒pRLTK、Dual-Luciferase?Reporter Assay Kit、小抽試劑盒、GloMax?Multi Jr單管型多功能檢測儀（美國Promega公司）；無縫克隆試劑盒（上海生博生物醫藥科技有限公司）；脂質體Lipofectamine2000、Opti-MEM（美國Invitrogen公司）。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采用細胞/組織基因組DNA提取試劑盒抽提大鼠腦組織DNA，具體實施步驟按照產品操作說明手冊進行。對提取DNA測量光密度（optical density，OD）值后，加ddH2O保存于-20℃。

1.2.2ASIC1基因啟動子序列PCR擴增及純化登陸美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI），搜索GenBank數據庫中的大鼠ASIC1 DNA序列（Gene ID：79123），利用Primer 5.0軟件輔助設計針對ASIC1基因啟動子區（-1545～+384）的引物，上游引物：5′-CTTACGCGTGCTAGCGCTTTATAGGTCGGCCATGGA-3′；下游引物：5′-ATCGCAGATCTCGAGCCTTGCCAAGGGGATCCTG-3′，上、下游引物分別引入酶切位點分別為Xho I、Nhe I，實驗所需引物均委托上海捷瑞生物工程有限公司進行合成。以所提取的大鼠腦基因組DNA為擴增模板，采用50μl反應體系：前段引物（10μmol/L）1.0μl、后段引物（10μmol/L）1.0μl、5×Buffer（with Mg2+）10μl、dNTP（各2.5 mmol/L）4μl、DNA模板1.0μl、PrimeSTAR 0.5μl，加ddH2O補足至50μl。循環條件為98℃預變性3 min；98℃變性10 s、55℃退火15 s、72℃延伸1 min，循環30次；72℃10 min終止反應。PCR產物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并對PCR擴增產物回收純化備用。

1.2.3pGL3-ASIC1-promoter載體的構建 用Xho I和Nhe I分別雙酶切PCR產物和pGL3-Basic載體，回收目的片段。將線性化載體和回收的目的片段以1：2（摩爾比）的比例加到試管中進行重組反應（42℃孵育30 min），放置2～3 min后取10μl反應液體轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，并涂布于含氨芐青霉素（100 mg/L）抗性的LB瓊脂平板上，37℃培養16 h后，從轉化子的平板上隨即挑取8個菌落，挑取菌落接種于10μl含氨芐抗性的LB培養液中。取培養后的菌液（1μl），進行菌落PCR，上游引物：5′-TCGCAGACACTCGTAGGCG-3′；下游引物：5′-CCTTATGCAGTTGCTCTCC-3′，以培養后的菌液為模板，采用20μl反應體系：前段引物（10 μmol/L）0.8μl、后段引物（10μmol/L）0.8μl、5× Buffer（with Mg2+）2μl、dNTP（各 2.5 mmol/L）1.6 μl、DNA模板1.0μl、Taq酶0.1μl，加ddH2O補足至20μl。循環條件為94℃預變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，循環30次；72℃10 min終止反應。進行凝膠電泳、觀察并照相。選取陽性克隆接種到LB液體培養基，37℃搖菌過夜；取含ASIC1啟動子的菌液行DNA測序，之后提取質粒備用。構建攜帶ASIC1基因啟動子序列的pGL3表達載體，命名為pGL3-ASIC1-promoter。

1.2.4熒光素酶報告基因載體轉染239T細胞293T細胞于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F-12培養基中進行培養，轉染前24 h將對數生長期的293T細胞消化計數（密度為1× 105個/孔），種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養至60%～70%，用50μl Opti-MEM培養基稀釋0.9μg質粒報告質粒和0.1μg pRL-TK質粒，同時1μl Lipofectamine2000溶于50μl Opti-MEM培養基中，5 min后將兩者混合室溫靜置20 min；用PBS清洗細胞3次后加入400μl Opti-MEM，再逐滴加入質粒-脂質體混合物，輕輕搖晃，置37℃、5%CO2培養6 h，然后更換含10%FBS的DMEM/F-12培養液500μl繼續培養48 h。實驗中將作為陰性對照的pGL3-Basic空載體與作為內參的pRL-TK質粒共轉染。每組試驗重復3次，試驗設6個復孔/次。

1.2.5熒光素酶報告基因活性的檢測 細胞轉染48 h后，棄培養液，PBS清洗細胞1次，室溫搖動15 min。按照雙熒光素酶檢測試劑盒的操作說明書，取100μl Luciferase Assay Buffer II于1.5 ml的離心管中；將GloMax?Multi Jr單管型多功能檢測儀測定間隔設定為2 s，測讀為10 s；將293T細胞裂解液轉移到新的1.5 ml離心管中，用移液器輕輕吸打2～3次混勻，切勿要旋渦振蕩，將離心管放入到化學發光儀中讀取螢火蟲熒光素酶發光值；再將離心管移出發光儀，加入100μl Stop&Glo Reagent，用移液器吹打混勻后，再將離心管放回多功能檢測儀中讀取海腎熒光素酶發光值，計算前者與后者的發光值的比值，即為被檢測質粒的相對熒光素酶活性（relative light unit，RLU）。

1.3統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，數據以ˉx±s表示，應用t檢驗行兩組間的差異性分析，以α=0.05作為檢驗水準。

2　結果

2.1pGL3-Basic載體雙酶切 用NheⅠ和XhoⅠ對pGL3-Basic表達載體（圖 1A）進行酶切，瓊脂糖電泳結果表明，在4 000～5 000 bp有明顯條帶，回收4 807 bp長度的pGL3-Basic載體片段（圖1B）。

2.2大鼠ASIC1基因啟動子的擴增 以基因組DNA為模板擴增ASIC1啟動子序列，擴增的 PCR產物經過1.2%瓊脂糖電泳后，結果可見在約2 000 bp處出現單一的明亮的條帶，與1 929 bp的 ASIC1啟動子片段大小相符合（圖2）。

2.3大鼠ASIC1基因啟動子熒光素酶報告質粒的構建與鑒定 PCR擴增大鼠ASIC1基因啟動子片段（-1545～+384）后，將其克隆至pGL3-Basic載體上構建 pGL3-ASIC1-promoter質粒。重組質粒經轉化后涂布于LB瓊脂平板上，挑取8個克隆搖菌，菌落PCR鑒定結果顯示均出現了陽性克隆片段（圖3A）；另外將所得陽性克隆送公司測序，DNA測序結果顯示，兩者序列一致（圖3B）。上述結果提示大鼠pGL3-ASIC1-promoter質粒已成功構建。

2.4大鼠ASIC1基因啟動子熒光素酶報告質粒的功能鑒定重組質粒 pGL3-ASIC1-promoter和pGL3-Basic質粒分別與內參質粒pRL-TK共轉染293T細胞后，觀察螢火蟲以及內參海腎熒光素酶報告基因活性，兩者活性的比值即為ASIC1啟動子活性，內參質粒pRL-TK可以排除由于轉染效率和細胞數目等因素不同所引起的組間差異，結果表明，與空質粒pGL3-Basic轉染組相比，重組質粒pGL3-ASIC1-promoter質粒轉染組的熒光素酶活性高14倍，兩者相比，差異有統計學意義（t=-19.077，P＜0.01）（圖4）。提示構建的大鼠pGL3-ASIC1-promoter質粒可以反映ASIC1啟動子的功能。

圖1　載體及雙酶切瓊脂糖電泳A：pGL3-Basic質粒載體圖譜；B：NheⅠ、XhoⅠ雙酶切后結果；M：Marker；1：4 807 bp的 pGL3-Basic片段

圖2　ASIC1啟動子PCR擴增結果M：Marker；1：1 929 bp的　ASIC1啟動子片段

圖3　pGL3-ASIC1-promoter質粒的鑒定A：菌落PCR擴增結果；M：Marker；1～8：8個克隆的　pGL3-ASIC1-promoter質粒菌落PCR擴增產物；B：pGL3-ASIC1-promoter質粒的測序圖譜（部分）

圖4　pGL3-ASIC1-promoter轉染293T細胞后的相對熒光素酶活性與pGL3-Basic組比較：**P＜0.01

3　討論

ASICs是一類H+門控的陽離子通道，當細胞外pH值下降（H+濃度上升）時，ASICs被激活，其離子通道打開，通過對Na+和Ca2+的通透形成內向電流，引起細胞膜去極化而產生興奮性效應；幾乎所有疾病如癌癥、炎癥、缺血、缺氧等的過程都會引起不同程度的pH值下降，而ASICs作為一種重要的酸感受器，感受這種變化進而影響著組織病理生理的改變［8］。近年來對ASICs的研究發展非常迅速，到目前為止，已克隆出來由4個基因編碼（ASIC1/Ac-cn2、ASIC2/Accn1、ASIC3/Accn3、ASIC4/Accn4）的7個 ASIC亞基：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4；其中ASIC1a因其可以參與Ca2+內流的調控并具有重要的生物學特性和病理生理學價值而深受關注［9］。大鼠ASIC1基因的全長約為28 620 bp，包括由13個外顯子和12個內含子，定位于第7號染色體7q36；其mRNA約3 800 bp，基因編碼528個氨基酸，蛋白質分子量約59 ku。近些年來，已有對ASIC1基因敲除、轉錄后水平調控及下游靶分子的研究［10-11］，但對于其轉錄水平調控研究較少。啟動子是轉錄激活過程中起動作用的特異的DNA序列，與序列上的轉錄因子結合后可以調節基因的轉錄，進而影響蛋白質翻譯，因此對于ASIC1基因啟動子研究顯得尤為必要。

目前，熒光素酶報告基因是檢測檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA相互作用的一種檢測方法；即將目的基因的啟動子序列插入到報告基因質粒中，然后將構建的質粒轉入相應的細胞中，最后通過觀察報告基因表達的水平，可反映插入的啟動子序列的功能［12-13］。在前期研究的基礎上，本實驗運用PCR技術擴增了ASIC1啟動子序列，并將這段序列定向克隆入pGL3-Basic載體中，菌落PCR和DNA測序分析證明導入序列、片段大小正確，成功構建了ASIC1的報告基因質粒。將構建成功的重組質粒pGL3-ASIC1-promoter與內參質粒pRL-TK共轉染到293T細胞中，采用雙熒光素酶報告基因（DLRTM）檢測系統進行相對表達活性的檢測。結果顯示，空載體pGL3-Basic陰性對照組的轉錄活性非常的低；而pGL3-ASIC1-promoter質粒轉染組有明顯的轉錄活性。證實了1 929 bp堿基ASIC1基因啟動子區啟動了熒光素酶的表達，提示這段靶序列具有較好的功能。成功構建出大鼠pGL3-ASIC1-promoter質粒是探究ASIC1表達轉錄的前提，這為進一步尋找ASIC1基因調控區中的順式作用元件及其轉錄因子、甲基化狀態提供了有效工具，也為探究和篩選ASIC1a的抑制劑奠定了前期基礎。

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Construction and identification of the rat ASIC1 promoter luciferase reporter p lasm id

Zhou Renpeng，Wu Xiaoshan，Wang Zhisen，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To construct ratacid sensing ion channel1（ASIC1）promoter recombined luciferase reportergene plasmid，and then identify its function.Methods Primers were designed and synthetised，ASIC1 promoter fragment from rat genome DNA was replicated by polymerase chain reaction（PCR）.The luciferase report gene pGL3-Basic reporter vector and ASIC1 promoter were digested with restriction enzymes NheI and XhoI separately，and then ASIC1 promoter was connected to pGL3-Basic reporter vector.293T cells were transiently co-transfected with the constructed pGL3-ASIC1-promoter plasmid and pRL-TK control plasmid，and then detected for luciferase activity after 48 hours.Results Rat ASIC1 gene promoter was amplified by PCR and pGL3-ASIC1-promoter reporter vector was successfully constructed，and the result of colony PCR and sequencing analysis of recombined plasmid were correct.The transcriptional activity of pGL3-ASIC1-promoter plasmid group was significantly increased compared to that of pGL3-Basic plasmid group（P＜0.01）.Conclusion The rat ASIC1 promoter luciferase reporter gene vector can be successfully constructed，which provides a pivotal basis for further study of regulatorymechanism of ASIC1 gene in transcription.

ASIC1；promoter；luciferase；reporter gene

R 392.2

A

1000-1492（2016）05-0620-05

2016-03-02接收

國家自然科學基金（編號：81271949）

安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

周仁鵬，男，博士研究生；

陳飛虎，男，博士生導師，責任作者，E-mail：cfhchina@sohu.com