Graves病131I或抗甲狀腺藥物治療前后外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞的變化

楊　靜，潘天榮，杜益君，鐘　興

Graves病131I或抗甲狀腺藥物治療前后外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞的變化

楊靜，潘天榮，杜益君，鐘興

目的 探討調節性T細胞（Treg）在Graves病（GD）患者外周血中變化，以及131I或抗甲狀腺藥物（ATD）治療后其變化趨勢，尋找評價131I和ATD治療療效的新指標。方法健康者40例設為對照組，初診GD患者40例設為GD組，并將GD組隨機分成131I治療組（20例）及ATD治療組（20例）。檢測131I治療組、ATD治療組治療前、治療后及對照組CD4+CD25+CD127lowTreg比例、白介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）水平，通過統計學軟件處理相關結果。結果 ①治療前GD組Treg比例較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；②131I治療組、ATD治療組治療后第3個月及第6個月Treg比例較治療前均升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；③治療后第3個月及第6個月，ATD治療組Treg比例與131I治療組差異無統計學意義；④治療前GD組IL-10、TGF-β1水平較對照組均降低，治療后6個月，細胞因子水平較治療前均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），各時間點131I治療組與ATD治療組之間，細胞因子差異無統計學意義。結論 GD患者Treg比例和功能顯著降低，治療后部分恢復，因此，對于甲亢患者，Treg可能是評價免疫狀態及治療后病情緩解的指標之一。

Graves病；調節性T細胞；碘131；抗甲狀腺藥物

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.036.html

Graves病（Graves disease，GD）又稱彌漫性毒性甲狀腺腫，是一種器官特異性自身免疫性疾病，主要表現為高代謝癥候群、彌漫性甲狀腺腫、突眼等多系統綜合征，其主要內科治療方法為抗甲狀腺藥物（antithyroid drugs，ATD）和放射性131I治療。但目前GD發病機制尚未完全清楚，并且治療效果、復發率的評價等尚無確切指標。調節性T細胞（Treg）自1995年被首次發現以來［1］，一直是免疫學者的研究熱點，其通過釋放抑制性細胞因子，抑制效應T細胞的功能，參與多種免疫抑制疾病的發生發展。Saitoh et al［2］發現CD4+CD25+Treg細胞與鋸齒類動物GD的發生及病情嚴重程度相關。該研究旨在研究GD患者外周血Treg細胞比例及功能變化，以及131I和ATD治療后其變化趨勢，尋找評價131I和ATD治療療效的新指標。

1　材料與方法

1.1病例資料 選擇2014年9月～2015年1月于安徽醫科大學第二附屬醫院內分泌科的門診或住院患者，根據中華醫學會內分泌學分會2008年頒布的《中國甲狀腺疾病診治指南》確診的初診GD患者40例（GD組），診斷標準為：臨床甲亢癥狀、甲狀腺彌漫性腫大、總三碘甲狀腺原氨酸（total triiodothyronine，TT3）及總甲狀腺素（total thyroxine，TT4）的水平升高、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）濃度減低、促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）陽性。排除GD合并眼病、應用免疫抑制劑、橋本甲狀腺炎合并甲亢、亞甲炎合并甲亢、繼發性甲亢、醫源性甲亢等。將GD組隨機分為放射性131I治療組（131I治療組）20例及抗甲狀腺藥物治療組（ATD治療組，以甲巰咪唑為治療藥物）20例。對照組為性別及年齡匹配的、無甲狀腺病病史及家族史、TT3、TT4、TSH、TRAb在正常值范圍內、2015年7月我院健康體檢者40例。兩組均排除經治GD、妊娠可能的育齡婦女以及有其它自身免疫性疾病、感染或患有各種惡性腫瘤的患者。

1.2試劑及儀器 異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD25單抗、藻紅蛋白（PE）標記的 CD127單抗、葉綠素蛋白偶聯物（PC5）標記的CD4單抗、流式細胞儀（FC500-MCL）等購自美國Beckman Coulter公司；溶血劑為0.83%的氯化銨溶液；分析系統軟件為CXP系統；檢測細胞因子白介素10（interleukin 10，IL-10）、轉化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）的ELISA試劑盒購自武漢華美公司。

1.3檢測方法 ATD治療組及131I治療組患者分別于治療前、治療后第3個月、第6個月抽取空腹靜脈血檢測以下指標，對照組患者在取得患者同意后抽取一次靜脈血測定相關指標。

1.3.1臨床指標的檢測 采用化學發光法測定外周血TT3、TT4、TSH、TRAb水平。

1.3.2外周血CD4+CD25+CD127lowTreg檢測 采用肝素鈉抗凝管取靜脈血2～3 ml，室溫下放置待用。CD4+CD25+CD127lowTreg采用三色直接免疫熒光標記法，首先在試管中加抗凝全血100μl，然后分別加入CD25-FITC、CD127-PE以及CD4-PC5單抗各10μl，充分混勻后室溫下避光反應15 min，加入1 ml溶血劑，37℃水浴箱內放置約10 min，待完全溶血時立刻上流式細胞儀檢測。檢測前對流式細胞儀進行光流路質量調控和熒光補償，使儀器各項指標均在質量控制允許值范圍內。檢測時首先根據前向（FSC）和側向（SSC）散射光信號對淋巴細胞群進行設門，每份標本獲取設門內細胞在10 000個以上，檢測后數據以Listmode文件形式保存。結果分析時，以CD4+淋巴細胞設門，分析CD25、CD127表達情況，以計算CD4+CD25+CD127lowTreg比例。

1.4細胞因子檢測 收集各樣本血清，儲藏于-80℃冰箱中待用。檢測時取出解凍、1 000 r/min離心15 min，采用ELISA試劑盒檢測IL-10、TGF-β1，嚴格按照說明書進行加樣、顯色、測定吸光度，試驗設置復孔。使用專業軟件制作標準曲線、計算樣本濃度。

1.5統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料數據均以ˉx±s表示；樣本間性別比較采用Χ2檢驗，各樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗或重復測量資料的方差分析。單因素相關分析采用Pearson相關分析。

2　結果

2.1治療前GD組與對照組相關指標比較 本研究共納入研究對象80例，GD組40例（男9例，女31例），對照組40例（男15例，女25例），兩組間性別比較差異無統計學意義（Χ2=2.14，P＞0.05）。GD組TT3、TT4和TRAb水平顯著高于對照組（P＜0.01），TSH水平顯著低于對照組（P＜0.01）；與對照組（6.08±0.83）比較，治療前GD組CD4+CD25+CD127lowTreg的比例（5.21±1.64）降低，差異有統計學意義（t=-2.99，P＜0.01），見表1。

表1　治療前GD組及對照組臨床指標比較（ˉx±s）

2.2131I和ATD兩種治療方法對CD4+CD25+CD127lowTreg比例的影響131I及ATD兩種方法治療后第3個月、第6個月時，CD4+CD25+CD127lowTreg比例較治療前均顯著增加（P＜0.01）。在治療6個月時CD4+CD25+CD127lowTreg比例與治療3個月比較差異均無統計學意義。治療后3個月和6個月，131I治療、ATD兩種治療方法之間的比較差異無統計學意義；治療前后與兩種治療措施之間不存在交互效應（F=0.32，P=0.73）。見表2、圖1。各組Treg占CD4+細胞比例見圖2。

表2　治療前后及　ATD和碘治療分別對 CD4+CD25+CD127lowTreg水平的影響

表2　治療前后及　ATD和碘治療分別對 CD4+CD25+CD127lowTreg水平的影響

與治療前比較：**P＜0.01

時間　131I治療組　ATD治療組　t值　P值治療前5.25±1.51　5.17±1.80　0.15＞0.05治療3個月　7.59±1.43**7.85±1.67**　-0.54　＞0.05治療6個月　7.33±2.56**7.63±1.38**-0.46　＞0.05

圖1　治療前后及　ATD和131I治療分別對 CD4+CD25+CD127lowTreg影響

2.3CD4+CD25+CD127lowTreg比例與甲狀腺功能、TRAb的相關性分析 Pearson相關分析顯示TRAb與Treg（r=0.17，P=0.29）、TT3與Treg（r=0.18，P =0.27）、TT4與Treg（r=0.21，P=0.20）、TSH與Treg（r=0.20，P=0.22）無顯著相關性。見圖3。

2.4細胞因子檢測 治療前GD組IL-10水平（20.25±4.41）與對照組（26.21±4.30）比較明顯降低（t=6.11，P＜0.05）。TGF-β1水平（1.62± 0.43）與對照組（2.64±0.64）比較明顯降低（t= 8.37，P＜0.05）。治療后6個月，細胞因子水平較治療前顯著升高（P＜0.05），ATD組與131I治療組之間，IL-10、TGF-β1水平比較差異無統計學意義，見表3、4。

表3　131I治療組及　ATD治療組治療前后　IL-10水平變化

表3　131I治療組及　ATD治療組治療前后　IL-10水平變化

項目131I治療組（n=20）ATD治療組（n=20）　t值　P值治療前20.45±4.78　20.05±4.31　0.28＞0.05治療后6個月　24.41±5.77　23.94±3.52　0.31＞0.05 t值　-2.36　-3.13 P值　＜0.05＜0.05

表4　131I治療組及　ATD治療組治療前后　TGF-β1水平變化

表4　131I治療組及　ATD治療組治療前后　TGF-β1水平變化

項目131I治療組（n=20）ATD治療組（n=20）　t值　P值治療前1.74±0.53　1.50±0.41　1.60＞0.05治療后6個月　2.25±0.79　2.12±0.59　0.59＞0.05 t值　-2.40　-4.29 P值　＜0.05＜0.05

圖2　CD4+細胞中　CD4+CD25+CD127lowTreg比例

圖3　Treg與 TRAb、TT3、TT4、TSH相關性分析散點圖A：TRAb；B：TT3；C：TT4；D：TSH

3　討論

Treg穩定機體免疫狀態和誘導免疫耐受作用的發現使得研究者們重新認識機體免疫平衡機制，并且使免疫治療成為可能。Foxp3特異性表達在Treg細胞胞內，并且在Treg的發育過程中發揮十分重要的作用，被公認為鑒定CD4+CD25+Treg細胞的特異性標志物［3］，但由于 Foxp3存在于胞內，檢測方法復雜，CD127在Treg細胞表面中特異性低表達或無表達，與Foxp3水平存在良好的相關性，使得CD4+CD25+CD127low成為篩選Treg的重要篩選標記［4］。

Treg通過細胞-細胞接觸抑制或釋放抑制性細胞因子（如IL-10、TGF-β1），發揮抑制效應性T細胞的免疫應答的作用［5］。本研究結果顯示，治療前GD組患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例及細胞因子IL-10、TG-β1水平均顯著低于對照者，提示GD患者不僅Treg比例失調，而且抑制功能也不同程度受損，導致其免疫耐受能力下降，對效應性T細胞的抑制能力減弱，這可能是導致自身免疫性甲狀腺疾病的發生發展的原因之一。多項研究［5-10］測定GD患者外周血中Treg細胞的比例或細胞因子較正常人均降低，與本研究結果一致。但研究［11-13］顯示，GD患者外周血Treg比例與正常者差異無統計學意義。其原因可能有：①部分研究［13］在納入研究對象時沒有檢測TRAb水平，不能排除納入患者中存在橋本甲亢患者；②選定不同的Treg表面因子對于Treg測定結果存在較大影響，例如Wang et al［9］選擇CD4+CD25+作為Treg分選標記，對Treg識別特異度不高，但是其檢測出的Foxp3水平較正常者顯著降低，差異有統計學意義；③樣本量與實驗結果存在相關性，孫偉莉等［12］實驗中，對照組僅10例，使得結果誤差大，可能并不能反應健康患者的真實水平。

本研究顯示，治療后隨著GD患者臨床癥狀的緩解及甲狀腺激素水平的降低，Treg比例及細胞因子（IL-10、TGF-β1）水平較治療前均顯著升高，該結果與Mao et al［6］報道一致，提示治療后患者免疫狀態的改善。查兵兵等［14］測定131I治療后1個月時Treg比例較治療前有增加趨勢，但差異無統計學意義，其原因可能是因隨訪時間過短，治療尚未達到預期效果，患者機體的免疫機制尚未達到穩態水平。

ATD治療GD時，其可通過誘導淋巴細胞凋亡達到抑制免疫反應的作用，減少甲狀腺特異性抗原的釋放［15］。而131I則利用β射線直接損傷甲狀腺濾泡細胞，導致其破裂、死亡，使甲狀腺素合成及分泌減少以達到治療作用，其對免疫狀態的影響目前尚未明確。本研究中，GD兩種治療方法間比較，ATD治療組Treg比例較131I組輕度升高，但細胞因子水平（IL-10、TGF-β1）低于131I組，兩組之間差異均無統計學意義。提示131I治療也可改善GD患者免疫功能，今后將進一步擴大樣本量，評價ATD及131I治療的作用。

本實驗亦研究了TRAb水平與Treg的相關性，然而，結果顯示TRAb水平與患者 Treg無明確相關性，提示TRAb水平高低并不能真實地反映患者免疫狀態，這與Mao et al［6］報道的結果不一致，可能因為目前臨床上檢測的TRAb并不是特異性反映甲狀腺受體刺激性抗體的水平有關，且不同的實驗試劑盒靈敏度及特異度均存在差異。

綜上所述，本研究顯示甲亢患者Treg比例及功能明顯降低，經ATD和131I治療后均可部分恢復，因此，對于甲亢患者，Treg可作為評價免疫狀態及治療后病情緩解的指標之一。下一步將進行長期隨訪，評價Treg的比例及功能變化是否與GD復發相關。

［1］ Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic selftolerancemaintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alphachains（CD25）.Breakdown of a singlemechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］.Immunol，1995，155（3）：1151-64.

［2］ Saiton O，Nagayama Y.Regulation of Graves'hyperhyroidism with naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cell in amousemod-el［J］.Endocrinology，2006，147（5）：2417-22.

［3］ Campbell D J，Koch M A.Phenotypical and functional specialization of FOXP3+regulatory T cell［J］.Nat Rev Immunol，2011，11（2）：119-30.

［4］ Liu W，Putnam A L，Xu Y Z，et al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function human CD4+Treg cells［J］.JExp Med，2006，203（7）：1701-11.

［5］ Hu Y，Tian W，Zhang L L，et al.Function of regulatory T-cells improved by dexamethasone in Graves'disease［J］.Eur JEndocrinol，2012，166（4）：641-6.

［6］ Mao CM，Wang S，Xiao Y C，et al.Impairment of regulatory capacity of CD4+CD25+regulatory T cells mediated by dendritic cell polarization and hyperthyroidism in Graves'disease［J］.J Immunol，2011，186（8）：4734-43.

［7］ 李曉玲，王存豐，翟亞萍，等.橋本甲狀腺炎和格雷夫斯病甲狀腺組織中淋巴細胞亞群分布及臨床意義［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27（12）：1156-8.

［8］ Nakano A，Watanabe M，Iida T，etal.Apoptosis-induced decrease of intrathyroidal CD4（+）CD25（+）regulatory T cells in autoimmune thyroid diseases［J］.Thyroid，2007，17（1）：25-31.

［9］ Wang H，Zhao S，Tang X，et al.Changes of regulatory T cells in Graves'disease［J］.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（5）：545-7.

［10］錢 偉，張 強，吳漢妮.Foxp3在Graves病患者外周血單個核細胞中的表達及臨床意義［J］.中國免疫學雜志，2011，27（1）：76-8.

［11］Pan D，Shin Y H，Gopalakrishnan G，etal.Regulatory T cells in Graves＇disease［J］.Clin Endocrinol，2009，71（8）：587-93.

［12］孫偉莉，申 勇，李衛鵬，等.Graves′病患者CD4+CD25+調節性T細胞功能初探［J］.安徽醫科大學學報，2015，50（2）：202 -5.

［13］查兵兵，劉 軍，洪曉武，等.外周血CD4+CD25+調節性 T細胞在Graves病發病中的作用［J］.中華內分泌代謝雜志，2012，28（6）：499-500.

［14］查兵兵，劉 軍，查 英，等.Graves病患者131I治療前后CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的變化［J］.中國免疫學雜志，2012，28（11）：1032-5.

［15］Cooper D S.Antithyroid drugs［J］.N Engl JMed，2005，352（9）：905-17.

Change of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in peripheral blood of patients w ith Graves disease treated by131I or antithyroid drugs therapy

Yang Jing，Pan Tianrong，Du Yijun，et al
（Dept of Endocrinology，The Second Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the changes of regulatory T cells（Treg）in Graves disease（GD）before and after being treated by131Ior antithyroid drugs（ATD），and to seek for new clinical indicators to evaluate the treatment response.Methods The study groups included 40 patients with GD（GD group），20 of whom were treated by131I，otherswere treated by ATD.Forty healthy donorswithout history of thyroid or autoimmune diseasewere enrolled in control group.The proportions of CD4+CD25+CD127lowTreg，IL-10 and TGF-β1 were tested before and after treatment respectively.Results ① The significant decrease in the proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in untreated GD patients（GD group）was found compared with the control group；②After treatment of131Ior ATD，the proportion of Treg was significantly higher than GD group in 3rd and 6th month（P＜0.05）；③There was no significant difference in the proportion of Treg between ATD group and131Igroup in 3rd and 6th month；④The characteristic of cytokine levels（such as IL-10，TGF-β1）was decreased in untreated GD group，and increased after being treated in 6thmonth（P＜0.05，respectively）.There was no significant difference in the cytokine levels between the131Igroup and ATD group at anymoment.Conclusion The proportion and function of Treg decrease in GD，but increase in both131Iand ATD therapy patients.The study shows that Tregmay play a critical role in affecting immunologic function and prognosis of GD patients.

Graves disease；regulatory T cells；131I therapy；antithyroid drugs

R 581.1

A

1000-1492（2016）05-0691-05

2016-02-25接收

安徽醫科大學第二附屬醫院內分泌科，合肥 230601

楊 靜，女，碩士研究生；

潘天榮，男，主任醫師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ptr1968@163.com