超聲波提取羅漢果渣中的黃酮優化工藝研究

李麗，李杰民，盛金鳳，李昌寶，孫健，*，何雪梅，廖芬，鄭鳳錦，零東寧，劉國明（.廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西作物遺傳改良重點開放實驗室，廣西南寧530007）

超聲波提取羅漢果渣中的黃酮優化工藝研究

李麗1，2，李杰民1，2，盛金鳳1，2，李昌寶1，2，孫健1，2，*，何雪梅1，廖芬1，鄭鳳錦1，零東寧1，劉國明1
（1.廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所，廣西南寧530007；2.廣西作物遺傳改良重點開放實驗室，廣西南寧530007）

羅漢果中黃酮類化合物含量高。選取提取溫度、提取時間、料液比3個因素，在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法研究了超聲波提取羅漢果渣中的黃酮的最佳工藝條件，結果表明，當超聲溫度50.65℃，料液比為1∶34.75（g/mL），超聲時間為29.2 min，此時黃酮得率最高，為2.25%。采用超聲波輔助法能夠有效的提取羅漢果渣中黃酮，方法簡單，時間短，效率高。

響應曲面法；超聲波；羅漢果渣；黃酮

羅漢果的植物學名“光果木鱉”，為中國特有的經濟藥用植物［1］。羅漢果的栽培品種較多，主要品種有青皮果、長灘果、拉江果、冬瓜果等［2］。在我國，羅漢果的產地主要在兩廣、福建省以及湖南省地區［3］，已有200多年的栽培歷史［4］。羅漢果在治療慢性氣管炎、百日咳、胃腸病、咽喉炎等方面有著非常顯著的療效［5-6］，日本學者竹本常送教授研究表明，羅漢果對各種疾病起主要療效作用的是一種被醫學上取名為甜甙的物質［7］。羅漢果對治療癌癥也有一定功效，我國國家中醫藥管理局、衛生局已將羅漢果列為第一批“既是食品又是藥品的品種名單”［8］。近幾十年來由于羅漢果甜甙及其制劑具有獨特的生理和臨床治療價值，國內外甜甙成份和功能的研究十分關注。然而，對于提取甜甙之后的羅漢果渣卻沒有得到利用［9-10］。羅漢果中富含黃酮類化合物，具有抗抑郁，抗氧化與消除自由基活性的作用，近年來被廣泛應用于醫藥領域［11-12］。

超聲波能在較低的溫度下大大促進溶劑提取有效成分的效率，降低生產時間、能源、溶劑的消耗以及廢物的產生，提高有效產率和提取物的純度，既降低了生產的費用，又合乎環境保護的要求，是一種有良好發展前途的新工藝［13-15］。本研究在單因素試驗的基礎上，研究了超聲時間、料液比、超聲溫度對羅漢果渣中黃酮得率的影響，采用響應曲面法研究了超聲波提取羅漢果渣中的黃酮的最佳工藝條件，為羅漢果的綜合利用提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅漢果渣：桂林吉福斯生物技術有限公司；蘆丁標準品：上海原葉生物科技有限公司。

JY-6002型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；DHS20-A型紅外水分測定儀：上海書培實驗設備有限公司；KQ5200B型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1羅漢果渣預處理

將羅漢果渣在熱泵干燥房中60℃干燥12 h，用多功能粉碎機將其打成粉末狀，混勻并裝于自封袋中備用（經測定水分含量為13%）。

1.2.2試驗測定流程與方法

準確稱取羅漢果碎渣適量，按一定料液比加入乙醇-水系統溶液，用超聲波清洗機超聲適當時間，抽濾，把濾液轉至100 mL容量瓶中，加入2 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，5 min后加2 mL10%的硝酸鋁溶液，搖勻，5 min后加5 mL 1 moL/L的氫氧化鈉溶液，搖勻10 min后于500 nm處測定吸光度值A。每個試驗均做3次，各平行測定3次A并取平均值，計算黃酮含量。

1.2.3標準曲線的測定

精確稱取蘆丁標準品20 mg，用70%乙醇溶解后轉到100 mL容量瓶中，淋洗燒杯3次，把淋洗液并入容量瓶中。最后用70%乙醇定容，搖勻后備用，得到蘆丁標準溶液濃度為0.2 mg/mL。用移液器準確吸取0.2 mg/mL蘆丁標準液0、1、2、3、4、5、6、7 mL，分別置于8支25 mL比試管中，各加70%的乙醇至10 mL，分別加入0.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，震蕩搖勻后靜置5 min。分別加入0.4 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置5 min。再分別加入1 mL 1 moL/L的氫氧化鈉溶液，震蕩搖勻，用70%的乙醇溶液定容到20 mL刻度處，震蕩搖勻，靜置10 min后于500 nm處測定吸光度值A（測3次取平均值），制作蘆丁標準曲線，得線性回歸方程A=8.840 48X-0.003 42（R2=0.999 04）。蘆丁標準曲線見圖1。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　Rutin standard curve

1.2.4提取工藝最優參數的確定

在單因素試驗時，依次改變超聲波提取時間、提取溫度、料液比，以羅漢果渣黃酮得率為評價指標進行研究和分析，結合以上單因素，采用Box-Behnken軟件來設計試驗方案。選取超聲提取溫度、料液比、超聲提取時間這3因素以及以-1、0、+1分別代表變量水平進行響應曲面試驗設計。因素水平的設計結果見下表1。

表1　響應曲面分析試驗因素水平及編碼表Table 1　Factors and levels coding of the response surface analysis

1.2.5統計分析

采用SPSS 17.0軟件（美國SPSS公司）中的Duncantest進行單因素方差分析（P＜0.05），Excel 2003作圖，圖表中各數據結果為3次試驗均值。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1超聲時間對提取羅漢果渣中的黃酮的影響

稱取10g羅漢果渣粉末，設定料液比1∶10（g/mL），超聲溫度50℃，分別調節不同的超聲時間10、20、30、40、50 min進行試驗，得到的超聲時間對黃酮得率影響結果見圖2。

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，提取黃酮的效率出現先增加后降低的趨勢。黃酮得率最低值出現在10 min處，最高值出現在30 min處。這是因為在反應開始后，羅漢果渣中的有效成分迅速溶出，隨著超聲時間的延長，部分有效成分分解，由此可見，超聲時間過短或者過長都不利于羅漢果渣中的黃酮提取，選擇超聲時間30 min提取效果最好。

圖2　超聲時間對黃酮得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

2.1.2超聲溫度對提取羅漢果渣中的黃酮的影響

稱取10 g羅漢果渣粉末，設定料液比1∶10（g/mL），調節超聲時間30 min，并設定不同的超聲溫度30、40、50、60、70℃，得到的超聲溫度對黃酮得率的影響結果見圖3。

圖3　超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，隨著超聲溫度的升高，黃酮得率先增加，當溫度到達50℃后，隨著溫度的升高，黃酮得率基本保持不變。為節約能源，降低成本，選用黃酮提取最佳溫度為50℃，黃酮得率達到2.27%。

2.1.3料液比對提取羅漢果渣中的黃酮的影響

稱取10 g羅漢果渣粉末，分別設定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比，超聲提取30 min，超聲溫度50℃，考察黃酮得率隨料液比變化的情況，結果見圖4。

圖4表明，隨著提取溶液的增加，黃酮得率呈現增加的趨勢，在料液比為1∶30（g/mL）時黃酮得率到達最高值，之后隨著提取溶液的增加，黃酮得率變化不大。這主要是因為在一定范圍內，料液比越高，單位料樣所接觸到的提取液的有效面積就越大，細胞的溶脹作用增強，有利于料樣中黃酮的溶出，表現為提取率的顯著升高；當繼續增加料液比時，單位料樣接觸到的有效溶液反而減少，因此隨著料液比的繼續升高，黃酮緩慢降低。故選取提取的最佳料液比為1∶30（g/mL）。

圖4　料液比對黃酮得率的影響Fig.4　Effect of material liquid ratio on extraction rate of flavonoids

2.2響應曲面法選擇最優試驗條件

用Design-Expert8.0.6 Trial軟件對表1進行試驗設計并優化出15組響應試驗數據，試驗數據見表2，其中零點試驗重復3次，用來估計試驗誤差。

表2　響應曲面分析試驗結果Table 2　The methods and results of the response surface analysis

對表2用Design-Expert8.0.6 Trial軟件進行回歸分析，得到黃酮提取率的二元多次回歸模型為：

對模型進行方差分析，得到分析表如表3。

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance for regression model

各因素對黃酮得率影響的大小順序為：超聲時間（X3）＞溫度（X1）＞料液比（X2）。模型中溫度（X1）、超聲時間（X3）影響極顯著（P＜0.01）；料液比（X2）影響顯著（P＜0.05）；二次項X32影響極顯著（P＜0.01），X2X3，X12影響顯著（P＜0.05），其余項均不顯著。

超聲溫度和料液比對黃酮得率的影響見圖5，超聲溫度和超聲時間對黃酮得率的影響見圖6，料液比和超聲時間對黃酮得率的影響見圖7。

圖5　超聲溫度和料液比對黃酮得率的影響Fig.5　Effects of ultrasonic extraction temperature and material liquid ratio on extraction rate of flavonoids

根據回歸方程，作出響應面和等高線，觀察擬合響應曲面的形狀，分析NaOH濃度、料液比和超聲波處理時間對黃酮得率的影響，如圖5～圖7所示。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖5～圖7可以看出，料液比和超聲時間交互作用顯著，其他因素之間的交互作用較小。

圖6　超聲溫度和超聲時間對黃酮得率的影響Fig.6　Effects of ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

圖7　料液比和超聲時間對黃酮得率的影響Fig.7　Effects of material liquid ratio and ultrasonic extraction time on extraction rate of flavonoids

2.3最佳提取工藝條件的確定

為了確定最佳提取工藝條件，對模型（1）取一階偏導等于零，得到一個三元一次方程組。用Matlab對該方程組求解，即可得超聲溫度50.65℃，料液比1∶34.75（g/mL），超聲時間29.2 min，此時黃酮得率最高為2.2642%。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，對預測結果進行了驗證，表明在此條件下實際測得的平均提取率為2.25%，與理論預測值相比，其相對誤差小于5%，說明采用響應曲面法優化得到的超聲波提取條件參數準確可靠，具有實用價值。

3　結論

本試驗選取超聲溫度、超聲時間以及料液比等因素，研究其對羅漢果渣中的黃酮提取效果的影響，經響應面優化試驗設計結果得出超聲波提取羅漢果渣的最佳工藝條件。各因素對黃酮得率影響的大小順序為：超聲時間＞溫度＞料液比，溫度、超聲時間對黃酮得率影響極顯著；料液比影響顯著，當超聲溫度50.65℃，料液比1∶34.75（g/mL），超聲時間29.2 min，此時黃酮得率最高2.25%。采用超聲波輔助法能夠有效的提取羅漢果渣，方法簡單，時間短，效率高。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Flavonoids from Marc of Siraitia grosvenorii

LI Li1，2，LI Jie-min1，2，SHENG Jin-feng1，2，LI Chang-bao1，2，SUN Jian1，2，*，HE Xue-mei1，LIAO Fen1，ZHENG Feng-jin1，LING Dong-ning1，LIU Guo-ming1
（1.Agro-food Science and Technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences （GXAAS），Nanning 530007，Guangxi，China；2.Guangxi Crop Genetic Improvement Laboratory，Nanning 530007，Guangxi，China）

Siraitia grosvenorii is rich in flavonoids.On the basis of single factor test，the response surface method was designed to study the effects of extraction temperature，extraction time，and material liquid rate on flavonoid extraction rate from mare of Siraitia grosvenorii so as to optimize experimental conditions.The results showed that the optimum condition for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids was as follows：extraction temperature of 50.65℃，material liquid rate of 1∶34.75（g/mL），and ultrasonic processing time of 29.2 min. Under this condition，the extraction rate of flavonoids was 2.25%.Ultrasonic-assisted method which was simple and efficiency could effectively extract flavonoids from mare of Siraitia grosvenorii.

responsesurfacemethodology；ultrasonicwave；mareofSiraitia grosvenorii；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.015

2014年中央財政農業技術推廣服務資金項目（桂財農函［2014］294號）；廣西農業科學院基本科研業務費（桂農科2015YT86；桂農科2015JM14）；廣西農業科學院發展基金（桂農科2013JQ13）

李麗（1983—），女（漢），副研究員，碩士，主要從事農產品加工研究與產品開發工作。

孫健（1978—），男，研究員，博士，主要從事農產品加工研究與產品開發工作。

2016-04-19