HPLC-MS/MS法同時檢測雞肉中的氯霉素和地塞米松

孫清榮，郭禮強（.山東科技職業(yè)學(xué)院，山東濰坊6053；.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊604）

HPLC-MS/MS法同時檢測雞肉中的氯霉素和地塞米松

孫清榮1，郭禮強2
（1.山東科技職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261053；2.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊261041）

建立了雞肉中氯霉素和地塞米松殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取氮氣吹干，正己烷脫脂后再經(jīng)乙酸乙酯反提取凈化，經(jīng)ZORBAX Eclipse Plus C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）柱分離，最后經(jīng)電噴霧離子化（ESI±）以多反應(yīng)離子監(jiān)測方式（MRM）內(nèi)標(biāo)法定量檢測。氯霉素和地塞米松的線性范圍分別為0.10 ng/ mL～40.0ng/mL和0.20ng/mL～40.0ng/mL，相關(guān)系數(shù)均不低于0.99；其定量下限分別為0.10 μg/kg和0.20 μg/kg，方法平均回收率分別為93.6%～102.2%之間和90.3%～95.8%，批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不高于5%。

串聯(lián)四級桿/線性離子肼質(zhì)譜；雞肉；氯霉素；地塞米松

2012央視曝光了“速生雞”事件，養(yǎng)殖戶為追求利益，違規(guī)超量使用抗生素和激素，從而進(jìn)一步引起人們對食品安全的關(guān)注。氯霉素是一種抑菌類合成抗生素，因?qū)Ω锾m氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有很強的活性，而表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力，廣泛地應(yīng)用于動物養(yǎng)殖業(yè)。由于氯霉素類抗生素能導(dǎo)致人體產(chǎn)生嚴(yán)重的再生不良性貧血［1］，歐盟、美國等對氯霉素的使用主要限定在外用，不得用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，動物源性食品中氯霉素的最高殘留限量為0.1 μg/kg，雖然在動物體內(nèi)殘留量低，但毒副作用依然存在。地塞米松屬于合成的糖皮質(zhì)激素［2］，具有抗炎、抗過敏和抗休克等作用，主要作為危重疾病的急救用藥和各類炎癥的治療。由于其能提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)畜禽生長，在畜牧生產(chǎn)中使用廣泛。過量使用該類激素有很大的副作用，如創(chuàng)口愈合不良、痤瘡或股骨頭缺血性壞死、骨質(zhì)疏松及兒童生長受到抑制、青光眼、白內(nèi)障等。動物生長過程中過量使用氯霉素和地塞米松會導(dǎo)致其在動物源性食品中的殘留，由食物鏈進(jìn)而影響人類健康。因此，開展雞肉中氯霉素和地塞米松的檢測方法具有重要意義。

目前國內(nèi)外關(guān)于氯霉素和地塞米松藥物的殘留檢測方法主要采用高效液相色譜法［3-8］、氣相色譜-質(zhì)譜法［9-10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11-15］，但由于雞肉基質(zhì)干擾較大，氯霉素和地塞米松性質(zhì)的差異，同時進(jìn)行樣品處理經(jīng)質(zhì)譜法檢測鮮見報道。本文利用高效液相色譜串聯(lián)四級桿/線性離子肼質(zhì)譜的高選擇性、快速正負(fù)切換和強抗干擾能力等特點，建立了雞肉中氯霉素和地塞米松殘留的快速定性定量檢測方法，能滿足雞肉進(jìn)出口檢測和國家藥物殘留監(jiān)控的要求。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀 ［AB eksigent ultra LC 100-XL/Qtrap 5500，配電噴霧離子源（ESI），工作站Analyst1.6.1］：美國AB公司；電子天平［AB135-S（0.01 mg）和PL202-L（0.01 g）各一臺］：英國Liselotte Mettler公司；離心機（5810型）：德國Eppendorf公司；移液器（100-1 000 μL）：德國Eppendorf公司；均質(zhì)器（T25型，18G刀頭）：德國IKA公司；振蕩器（MMV-1000W）：ETELA公司；氮吹儀（N-EVAP）：美國Organomation Associates公司；渦流混勻器（MS3 basic）：德國IKA公司。

氯霉素和氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品（德國Laboratories of Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥98%，批號：201312）；地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma-Aldich公司，純度≥98.5%，批號：201207），做氯霉素內(nèi)標(biāo)使用。

甲基強的松龍標(biāo)準(zhǔn)品（美國DON公司，純度≥98%，批號：201309），做地塞米松內(nèi)標(biāo)使用；甲醇為色譜純；乙酸乙酯和正己烷為分析純。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1）精密稱取氯霉素、氯霉素-D5、地塞米松、甲基強的松龍標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置100 mL量瓶中，甲醇溶解，定容。分別制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；甲基強的松龍用丙酮溶解配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于4℃冰箱中放置，備用。

2）用移液器分別移取1 mL氯霉素、氯霉素-D5、地塞米松和甲基強的松龍儲備液用甲醇定容至100 mL，分別配成濃度為1 μg/mL的中間儲備液；

3）分別移取氯霉素中間儲備液1 mL到100 mL容量瓶，地塞米松中間儲備液2 mL到100 mL容量瓶，用甲醇定容至100 mL，混標(biāo)工作液中氯霉素濃度為10 ng/mL，地塞米松濃度為20 ng/mL；分別移取氯霉素-D5中間儲備液2 mL到100 mL容量瓶，甲基強的松龍中間儲備液4 mL，用甲醇定容至100 mL，氯霉素-D5濃度為20ng/mL、甲基強的松龍濃度為40ng/mL。

試驗中用甲醇配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為0、0.10、0.50、2.0、10.0、40.0 ng/mL，氯霉素-D5終濃度為2.0 ng/mL；地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為0、0.20、0.50、2.0、10.0、40.0 ng/mL，甲基強的松龍終濃度為4.0 ng/mL。

1.3提取

精密稱取（10±0.01）g雞肉樣品于具塞離心管中，各樣品管加入內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，加標(biāo)回收管再加入100 μL外標(biāo)工作液。各管加入15 mL乙酸乙酯均質(zhì)，28 000 g離心10 min，上清液移入30 mL做好標(biāo)記的玻璃管；具塞離心管重新加入15 mL乙酸乙酯重復(fù)以上操作，合并上清液氮氣吹干。在玻璃管中各添加5 mL正己烷和5 mL水，渦混1 min，去除上層溶液；若下層溶液不干凈，重復(fù)操作1次。各管添加5 mL乙酸乙酯，渦混1 min，取上層溶液到10 mL玻璃管氮氣吹干。用甲醇-水（3∶7，體積比）定容到1 mL，過0.22 μm的濾膜后待用。

1.4試驗方法

采用內(nèi)標(biāo)法定量，分別以氯霉素-D5為內(nèi)標(biāo)物測定氯霉素的含量；甲基強的松龍為內(nèi)標(biāo)物測定地塞米松的含量。

1.5儀器參數(shù)與測定條件

1.5.1液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（1.7 μm，3.0× 100 mm）；柱溫：40℃，流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A純水，B甲醇，梯度洗脫程序：0→2.0 min，由15%B→85%B；2.0→3.5 min，85%B；3.6 min，15%B，平衡2.4 min。

1.5.2質(zhì)譜條件

電離方式：ESI±；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：450℃；GAS1：55 L；GAS2：60 L；電子倍增器電壓：4 500 V；碰撞氣：高純氮，99.99%，4種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的建立和優(yōu)化

為摸索最佳質(zhì)譜條件，減少儀器干擾和污染，配制混合標(biāo)準(zhǔn)品氯霉素和地塞米松含量在50 ng/mL，控制信號強度在106范圍內(nèi)，采用針泵直接進(jìn)質(zhì)譜方法篩選條件，流速20 μL/min，根據(jù)文獻(xiàn)資料［16］，先在負(fù)離子模式進(jìn)行掃描查找氯霉素和氯霉素-D5母離子，找出后對其子離子進(jìn)行全掃描，通過優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能量，找出豐度較強的碎片離子，組成監(jiān)測離子對。將掃描模式改為正離子模式，重復(fù)以上操作找到地塞米松和甲基強的松龍的監(jiān)測離子對。以純水和甲醇作為流動相，設(shè)定優(yōu)化液相條件數(shù)據(jù)見圖1。

在上述色譜和質(zhì)譜條件下，氯霉素（0.10 ng/mL）和地塞米松（0.20 ng/mL）能夠分離良好，且峰形很好，在空白組織中未見干擾。

表1　氯霉素和地塞米松的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1　Mass spectrometric acquisition parameters of chloramphenicol and dexamethasone

2.2提取和凈化條件的選擇

氯霉素和地塞米松等屬于極性物質(zhì)，可以通過有機溶劑進(jìn)行提取。由于雞肉中含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪等符合組分，基質(zhì)復(fù)雜，本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯4種溶劑對氯霉素和地塞米松的提取回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖1　氯霉素和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)、外標(biāo)和雞肉空白樣品的提取離子色譜圖Fig.1　Extracted ion chromatograms of chloramphenicol and dexamethasone in standard solution，internal standard solution and blank chicken samples

結(jié)果證明，乙酸乙酯的提取效率最高，兩種藥物的提取回收率達(dá)到了90%以上，適合雞肉組織中氯霉素和地塞米松的提取。雞肉基質(zhì)中非極性脂類物質(zhì)較多，基質(zhì)干擾較大，影響結(jié)果的判定，經(jīng)過多次試驗比較，最終選定用乙酸乙酯萃取兩次，氮氣吹干后加水溶解再用正己烷脫脂，再次用乙酸乙酯反提取，氮氣吹干過濾膜后經(jīng)質(zhì)譜檢測，空白基質(zhì)加標(biāo)回收率在90%～107%之間。以本試驗開發(fā)的方法可以有效去除基質(zhì)干擾，省去了固相萃取柱的使用，節(jié)約了費用，可以同時對氯霉素和地塞米松進(jìn)行提取純化，減少了樣品前處理的時間和成本，可以滿足日常監(jiān)測的要求。

圖2　不同提取溶劑時氯霉素和地塞米松的回收率Fig.2　Recoveries of chloramphenicol and dexamethasone using different extraction solvents

2.3線性范圍、檢出限、定量下限

在優(yōu)化的色譜條件下對所配制的系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以測得的化合物峰面積的比值（氯霉素峰面積/氯霉素-D5峰面積或地塞米松峰面積/甲基強的松龍峰面積）Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度X（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩種化合物的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。在空白雞肉基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)品，調(diào)整適合的濃度，以3倍的信噪比計算方法的檢出限（LOD）；10倍的信噪比計算方法的定量下限（LOQ），兩種化合物的檢出限和定量下限見表2。

表2　氯霉素和地塞米松的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限（n=6）Table 2　Linear equation，correlation coefficients（r），limits of detection（LOD）and limits of quantitation（LOQ）of chloramphenicol and dexamethasone（n=6）

從表2可知，所有指標(biāo)都符合我國和歐盟的殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)。

2.4回收率和精密度

選取陰性雞肉樣品，添加氯霉素和地塞米松混合標(biāo)準(zhǔn)品，對雞肉基質(zhì)進(jìn)行了6天次添加回收率重復(fù)試驗，氯霉素的3個添加濃度分別為0.1、0.2.1.0 μg/kg，地塞米松的3個添加濃度分別為0.2、0.4、2.0 μg/kg，每次每個濃度點重復(fù)試驗6次。結(jié)果表明，雞肉基質(zhì)中氯霉素平均添加回收率在93.6%～102.2%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.7%～4.5%之間，批間RSD 在3.1%～4.7%之間；雞肉基質(zhì)中地塞米松平均添加回收率在90.3%～95.8%之間，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在3.1%～4.3%之間，批間RSD在3.7%～4.6%之間，兩種化合物的回收率和RSD見表3。

表3　陰性雞肉樣品中添加氯霉素和地塞米松的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3　Spiked recoveries and RSDs of chloramphenicol and dexamethasone in chicken samples（n=6）

2.5實際樣品的檢測

應(yīng)用本方法對200個雞肉樣品同時進(jìn)行氯霉素和地塞米松檢測，其中1個樣品中的氯霉素殘留量為0.16 μg/kg，達(dá)到了歐盟進(jìn)口的限量標(biāo)準(zhǔn)，陽性率為0.5%；地塞米松未檢出。但上述樣品的藥物殘留量均小于國家殘留監(jiān)控的限量要求，結(jié)果見圖3。

圖3　氯霉素和地塞米松陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.3　Extracted ion chromatograms of chloramphenicol and dexamethasone in positive chicken samples

3　結(jié)論

本文建立了雞肉中氯霉素和地塞米松殘留同時測定的串聯(lián)四級桿/線性離子肼質(zhì)譜的分析檢測方法。該方法提高了方法定性定量的準(zhǔn)確性，操作簡便，省去了固相萃取步驟，靈敏度和回收率好，可滿足實際檢測工作的需要。

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Simultaneous Determination of Chloramphenicol and Dexamethasone in Chicken by HPLC-MS/MS

SUN Qing-rong1，GUO Li-qiang2
（1.Shandong Vocational College of Science and Technology，Weifang 261053，Shandong，China；2.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，Shandong，China）

A method for the determination of chloramphenicol and dexamethasone in chicken was developed using high performance liquid chromatography coupled tandem quadrupole linear ion trap mass spectrometry. The target analytes were extracted with ethyl acetate，and evaporated to dryness．The extracts were defatted with hexane and extracted by ethyl acetate again.chloramphenicol and dexamethasone were detected with electrospray ionization in both positive and negative modes using multiple reaction monitoring，and quantified by the internal standard method after separation through ZORBAX Eclipse Plus C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）.With the optimal conditions，the calibration curves of chloramphenicol and dexamethasone were linear in the ranges of 0.10 ng/mL-40.0 ng/mL and 0.20 ng/mL-40.0 ng/mL，and correlation coefficients no less than 0.99.The limits of quantitation（LOQs）were 0.1μg/kg and 0.2μg/kg respectively.The average recoveries of chloramphenicol and dexamethasone were ranged from 93.6%to 102.2%and 90.3%to 95.8%respectively with both RSD not more than 5%．

tandemquadrupolelineariontrapmassspectrometry；chicken；chloramphenicol；dexamethasone

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.038

濰坊市2015年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃（2015ZJ1101）；科技部星火計劃（2014GA740082）

孫清榮（1970—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：分析檢測。

2015-02-17