間充質干細胞治療實驗性類風濕性關節炎的療效及相關機制分析

邊振宇 王雪鵬 沈蘭娟 李茂強 姚旺祥 朱六龍★

間充質干細胞治療實驗性類風濕性關節炎的療效及相關機制分析

邊振宇 王雪鵬 沈蘭娟 李茂強 姚旺祥 朱六龍★

目的 分析關節內注射和聯合靜脈注射間充質干細胞（MSC）對實驗性類風濕性關節炎（RA）的療效，并分析相關機制。方法 膠原誘導的RA模型大鼠，采用關節內注射MSC、經靜脈注射MSC及關節內注射聯合靜脈注射MSC治療，通過后肢體積、關節炎指數，炎癥關節的病理檢查評價治療效果，通過動物血漿內TNF-α及IL-10檢測及MSC與大鼠脾臟淋巴細胞共培養分析MSC治療的相關機制。結果 關節內注射MSC或靜脈注射MSC均可降低實驗性RA模型大鼠的關節炎指數，且二種方法具有協同作用，病理檢查證明MSC治療后RA模型的軟骨破壞減輕。ELISA檢測顯示MSC治療后RA動物模型血漿促炎細胞因子TNF-α的水平顯著降低，而抑炎細胞因子IL-10的水平顯著升高，同時共培養實驗表明MSC可顯著抑制II型膠原誘導的T淋巴細胞增殖。結論 MSC可有效治療實驗性RA，治療作用與MSC的免疫抑制作用相關。

類風濕性關節炎 間充質干細胞 腫瘤壞死因子-α 白細胞介素-10

類風濕性關節炎（RA）是一種慢性炎癥性免疫性疾病，發病機制尚不明確，目前還無滿意的治療方法。研究［1，2］表明靜脈注射間充質干細胞（MSC） 可顯著降低膠原誘導的關節炎（CIA）的發生率，并減輕實驗性關節炎的嚴重程度，且MSC治療可顯著抑制多種炎癥介質的產生，并可誘導抗炎性細胞因子白介素10 （IL-10）的產生，而MSC能夠誘導具有抑制膠原特異性T細胞反應的抗原特異性Treg細胞的產生。2014年12月至2015年10月作者通過動物實驗，探討MSC靜脈注射聯合關節內注射治療RA的療效及相關機制，報道如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物與主要試劑 清潔級雌性SD大鼠22只，體重180～200g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養于杭州師范大學清潔級實驗動物飼養中心。DMEM及RPMI-1640培養基（GIBCO公司），胎牛血清（GIBCO公司），牛Ⅱ型膠原（Chondrex，Inc.），弗氏不完全佐劑（Sigma F5506-10ml），甲基噻唑基四唑（MTT）（SIGMA公司），淋巴細胞分離液（灝洋生物，LTS1083PK），大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）及IL-10的ELISA試劑盒（Quantikine，R&D Systems Inc. USA），24孔transwell（直徑6.5mm，孔徑0.4μm，BD公司），酶標儀（ELx800，美國Bio-Tek）。

1.2方法 （1） MSC的分離與培養：無菌條件下取出大鼠的股骨及脛骨，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，顯露骨髓腔，用無血清培養基沖出骨髓，制成單細胞懸液，1200r/min離心5min后棄上清液，重懸后以106/ml的細胞濃度接種于25cm2培養瓶中，置于37℃飽和濕度的培養箱內進行培養。原代培養過程中，48h后更換培養基，以后每3d全量更換培養基。待細胞生長至80%融合時，以1：2的比例進行傳代培養。（2）培養的MSC的鑒定：① MSC分化檢測：利用成骨誘導培養基（添加50μg/ml抗壞血酸、10mM β磷酸甘油、0.1μM地塞米松）、成脂誘導培養基（添加1μM地塞米松、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μg/ml胰島素）誘導分化12d，再檢測其成骨［堿性磷酸酶（ALP）染色］與成脂肪（油紅染色）。②流式細胞表型分析鑒定：收集P2代細胞，制成單細胞懸液，PBS洗滌2次，將106細胞移至Eppendorf管中，分別和流式檢測用CD90、CD73、CD45、CD34單克隆抗體各20ml避光孵育30min，再用PBS洗滌并離心，洗去未結合熒光抗體，流式細胞儀檢測表面抗原情況。（3）實驗性RA（ CIA）大鼠模型的建立：將濃度為2mg/ml的牛Ⅱ型膠原（CⅡ）冰醋酸溶液和弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，制成 CⅡ乳劑。將該乳劑以0.2ml/只皮內注射于大鼠尾部的背側。第1次注射7d后，在大鼠尾部的腹側皮內注射0.1ml乳劑。用關節炎指數（AI）作為判斷標準［3］。AI 值=四肢肢體關節腫脹級評分之和（Ⅰ級為1分，總分為 16 分）。（4） 分組與處理：將成模 SD大鼠隨機分為4組（每組4只）。1組：尾靜脈注入100μl PBS作為對照組。2組：通過尾靜脈注入100μl MSC細胞懸液（107細胞）。3組：在RA關節腔內注入100μl MSC 細胞懸液（107細胞）。4組：通過尾靜脈注入100μl MSC 細胞懸液（107細胞）并在RA 關節腔內注入100μl MSC 細胞懸液（107細胞）。所有組別均為模型復制后12h干預。（5）檢測指標：①動物模型足爪體積：于治療干預后的24h、72h、7d 及14d用排水法測量大鼠雙后肢足爪體積。②關節炎指數計算：于治療干預后的24h、72h、7d及14d采用關節炎指數評定關節炎病變的發生及嚴重程度，算出AI。 ③處死動物后采用組織學方法對后足各關節進行HE染色。④ 分離動物脾臟淋巴細胞，檢測MSC對脾臟淋巴細胞增殖的影響：無菌條件取大鼠脾臟，采用梯度離心法獲取淋巴細胞［4］。Transwell細胞培養：將含有2×104MSC的200μl細胞懸液加入transwell上室，下室加入600μl 含有105淋巴細胞的細胞懸液，在Transwell下室內加入10μg/ml Ⅱ型膠原刺激淋巴細胞，上室內不加入MSC作為對照。72h后取出Transwell上室后，下室每孔加入100μl 5mg/ml的MTT溶液，孵育4h后加入500μl DMSO，用酶標儀在570nm波長檢測吸光值。⑤動物模型血漿內TNF-α及IL-10的檢測：采用肝素化的注射器通過心臟穿刺采集大鼠的血液，以6000r/min離心10min分離血漿與血液內的有形成分，收集上層血漿用于行ELISA檢測。ELISA的檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。兩樣本比較用t檢驗，多個樣本比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠骨髓MSC的分離、培養及鑒定 培養1周后可見典型的細胞克隆生長，P2代骨髓MSC大部分成梭形，少部分成多角形（見圖1A）。成骨分化：行ALP染色可見大部分細胞呈ALP陽性反應（見圖1B）。成脂分化：采用油紅O染色，可見細胞質內的油滴為油紅O染色（見圖1C）。將P3代MSC消化成單細胞懸液進行免疫熒光染色，行雙陽性抗體、雙陰性抗體共同標記，流式細胞檢測顯示CD73與CD90呈陽性表達，而CD34與CD45呈陰性表達，符合MSC的典型特征（見圖1D）。

圖1　大鼠MSC的培養、分化及流式鑒定

2.2MSC治療對后肢體積的影響 治療后第1、3、7 及14天時，2、3、4組的后肢體積逐漸減小，14d時，2、3、4組的后肢體積顯著小于1組（P＜0.001），且4組的后肢體積顯著小于2、3組（P=0.047）。（見表1）。

表1　MSC治療對后肢體積的影響［cm3，（±s）］

表1　MSC治療對后肢體積的影響［cm3，（±s）］

注：與1組比較，*P＜0.001，與2、3組比較 #P＜0.05

組別（n=4）　0d　1d　3d　7d　14d 1組（對照組）　2.00±0.37　2.03±0.37　1.95±0.31　1.85±0.24　2.16±0.26 2組　2.08± 0.34　2.18±0.59　1.93±0.33　1.83±0.19　1.78±0.23* 3組　2.10±0.61　2.05±0.37　1.95±0.31　1.78±0.28　1.75±0.10* 4組　2.00±0.67　2.00±0.67　1.80±0.41　1.67±0.29　0.96±0.10*#

2.3MSC治療對AI的影響 治療后第1、3、7及14天時，2、3及4組的AI逐漸減小；第7天時，2、3 及4組的AI顯著小于1組（P＜0.05）；第14天時，2、3、4組的AI顯著小于1組（P＜0.001），且4組的AI顯著小于2組與3組（P=0.035）。（見表2）。

表2　MSC治療對AI的影響（±s）

表2　MSC治療對AI的影響（±s）

注：與1組比較 *P＜0.05或*P＜0.01，與2、3組比較#P＜0.05

組別（n=4）　0d　1d　3d　7d　14d 1組（對照組）　6.75±1.50　7.00±1.15　6.50±1.73　6.00±1.83　7.00±0.82 2組　6.50±1.91　6.25±2.06　4.75±2.06　4.00±1.83*　3.50±0.58* 3組　6.00±1.83　6.00±1.83　5.25±1.50　4.50±1.29*　3.25±0.50* 4組　5.25±1.89　5.25±1.89　3.75±1.71　2.25±0.50*　1.00±0.00*#

2.4HE染色結果 第1組動物后肢關節軟骨壞死脫落、纖維化，關節腔狹窄，跗骨、跟骨骨質吸收，炎細胞大量浸潤。2、3及4組的關節炎癥及關節破壞程度輕于1組，且4組的關節炎癥及關節破壞程度輕于2組與3組。（見圖2）。

圖2　各組大鼠后肢HE切片檢查

2.5對大鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響 MSC組的吸光值顯著低于對照組（P=0.001），提示MSC可抑制由II型膠原誘導的T淋巴細胞增殖（見表3）。

表3　MSC共培養對大鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響（±s）

表3　MSC共培養對大鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響（±s）

注：與對照組比較 *P=0.001

組別（n=4）　吸光值MSC組　0.42±0.02*對照組　0.76±0.10

2.6動物模型血漿內TNF-α及IL-10的檢測 治療后第14天，2、3、4組大鼠的血漿TNF-α濃度顯著低于1組（P＜0.05），且4組血漿TNF-α濃度顯著低于2、3組（P=0.002）。2、3、4組大鼠的血漿IL-10濃度顯著高于1組（P＜0.05），且4組血漿IL-10濃度顯著高于2、3組（P＜0.001），見表4。

表4　各組動物模型血漿內TNF-α與IL-10濃度比較（±s）

表4　各組動物模型血漿內TNF-α與IL-10濃度比較（±s）

注：與1組比較，*P＜0.001，與2、3組比較，#P＜0.05

組別　TNF-α （pg/ml）　IL-10 （pg/ml）1組　62.39±5.09　17.40±1.94 2組　54.10±1.55*　23.21±1.24* 3組　54.04±2.53*　22.84±1.67* 4組　43.41±5.14*#　32.41±1.68*#

3　討論

RA是一種慢性炎癥性免疫性疾病，最終可導致關節強直畸形和功能喪失［5］。由于MSC具有免疫調節功能并可抑制多種免疫細胞的功能，因此有學者探索應用MSC治療自體免疫性疾病的可行性，如系統性紅斑狼瘡［6］。促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17在RA中起重要病理作用［3］。

本資料顯示2、3、4組在經尾靜脈注射MSC或（和）關節內局部注射MSC后，模型大鼠的后肢足墊厚度、后肢體積以及AI逐漸減小，至注射后2周時，3個組的后肢足墊厚度、后肢體積以及AI均顯著小于第1組。此外，后肢關節的HE染色檢查表明，2組與3組動物模型的關節炎較1組輕微且軟骨破壞減輕，4組模型的關節炎比1組輕微且無軟骨破壞。ELISA結果顯示2、3、4組動物血漿內的TNF-α的水平顯著低于1組，且4組的血漿TNF-α的水平顯著低于2、3組；而2、3、4組動物血漿內的IL-10的水平均顯著高于1組，且4組的血漿IL-10水平顯著高于2、3組。提示經靜脈注射MSC對實驗性RA具有治療作用，且與既往的文獻報道一致［1，2，7］。

本資料結果表明MSC可抑制由II型膠原誘導的淋巴細胞增殖，提示MSC具有免疫抑制作用，可抑制淋巴細胞對II型膠原的免疫反應，與其他研究一致［8］。本資料ELISA結果表明經靜脈注射MSC或關節內注射MSC后可顯著降低促炎細胞因子TNF-α的水平，且升高抗炎細胞因子IL-10的水平，與既往的文獻報道一致［3］。而將靜脈注射MSC及關節內注射MSC 2種方法聯合后TNF-α的水平進一步降低，而IL-10的水平進一步升高，提示這2種治療方法具有協同作用。MSC通過抑制淋巴細胞增殖實現的免疫抑制及抑制促炎因子分泌的作用，實現對實驗性RA的治療作用。然而其詳細機制還需進一步研究。

本資料提示大鼠靜脈軀體注射MSC聯合關節內注射MSC可有效治療實驗性RA，為臨床治療RA提供了一種全新選擇，應用MSC治療RA具有廣闊的治療前景，將產生有價值的社會及經濟效應。

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Objective To analyze the therapeutic effects of intra-articular injection of mesenchymal stem cells （MSCs） combined with systemic injection of MSCs in treating experimental rheumatoid arthritis，and the underlying mechanism. Methods Collagen-induced arthritis models were established using rats，then these models were treated by intra-articular injection of MSCs，systemic injection of MSCs，and intra-articular injection combined with systemic injection of MSCs. And the therapeutic effects were evaluated by measuring the hind limb volumes，arthritis indices，and pathological examination of inflamed joints. The underlying mechanisms were analyzed by detecting plasma levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and Interleukin-10 （IL-10） of rat models，and coculturing MSCs and spleen lymphocytes from rat models. Results Both intra-articular and systemic injection of MSCs can significantly lower arthritis indices of experimental rheumatoid arthritis models，and there were synergistic effects between the two ways of injection. Pathologic analysis demonstrated that cartilage destruction of animal models was less severe after MSCs treatment. ELISA assays indicated that the levels of pro-inflammatory cytokines，TNF-α，decreased significantly，and levels of anti-inflammatory cytokines，IL-10，increased significantly. Coculture of MSCs and spleen lymphocytes demonstrated that MSCs significantly inhibited type II collagen induced proliferation of T lymphocytes. Conclusions MSCs have significant therapeutic effects on experimental rheumatoid arthritis，which is related to their immunosuppressive effect.

Rheumatoid arthritis Mesenchymal stem cells Tumor necrosis factor-α Interleukin-10

杭州市醫藥衛生科技計劃項目（2010A007）

310006 浙江省杭州市第一人民醫院 骨科