重樓總苷Ⅰ對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系ARPE-19增殖、遷移的影響

蘇菲菲，盧木娣，曾惠紅，江文良，賴文娟，梁堂鈺，賴雪燕，龍劍文

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重樓總苷Ⅰ對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系ARPE-19增殖、遷移的影響

蘇菲菲1，盧木娣1，曾惠紅1，江文良1，賴文娟1，梁堂鈺1，賴雪燕1，龍劍文2

目的 探討重樓總苷Ⅰ對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系（ARPE-19）增生、遷移的影響。方法 MMT法檢測重樓總苷Ⅰ對ARPE-19細胞增殖的影響，Transwell小室實驗檢測ARPE-19細胞侵襲能力的變化，劃痕實驗檢測ARPE-19細胞遷移能力的變化，實時熒光定量PCR檢測ERK1/2 mRNA的表達，Western blot法檢測ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達水平。結(jié)果 重樓總苷Ⅰ可抑制ARPE-19細胞的增生、侵襲、遷移，下調(diào)p-ERK1/2蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但對總ERK1/2表達、ERKl mRNA和ERK2 mRNA表達無明顯影響。結(jié)論 重樓總苷Ⅰ能有效抑制ARPE-19細胞的增殖、侵襲、遷移，可能與重樓總苷Ⅰ抑制了ARPE-19細胞ERK1/2蛋白磷酸化有關，為中藥重樓治療增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾病提供了依據(jù)。

重樓總苷Ⅰ；增殖；遷移；視網(wǎng)膜色素上皮細胞

網(wǎng)絡出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.016.html

人視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細胞增生、遷移，細胞外基質(zhì)成分（extracellular matrix，ECM）異常沉積，形成有收縮能力的增生膜，是增生性玻璃體視網(wǎng)膜疾病（PVR）發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［1］。研究［2］表明，RPE細胞在PVR的發(fā)展中起著最重要的作用。重樓是中醫(yī)治療PVR的常用藥物之一［3］，研究［4-6］表明，其有效成分重樓總苷Ⅰ對一些腫瘤細胞有抑制作用，但對人RPE細胞作用如何，目前暫無報道。該研究觀察了重樓總苷Ⅰ對人RPE細胞增生、遷移的影響，以及對其ERK1/2 mRNA表達、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達的影響，探討重樓總苷Ⅰ治療PVR的可能機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器 重樓皂苷Ⅰ粉劑購自中國藥品生物制品檢定所；人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系（ARPE-19）細胞株購自武漢大學細胞庫中國典型培養(yǎng)物保藏中心；100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素、MTT試劑盒購自武漢博士德生物公司；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；分光光度儀購自芬蘭Labsystems公司；細胞培養(yǎng)箱（熱電3111型）購自美國熱電公司；TRIzol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；Quantonestep RTPCR Kit購自北京天根生化公司；ERK1/2、p-ERK1/ 2、辣根酶標記抗鼠lgG抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根酶標記的β-actin抗體購自上海興悠生物科技有限公司；ECL試劑盒購自美國Amersham Biosciences公司；Transwell小室購自美國Millipore公司。

1.2MTT法檢測不同濃度藥物對ARPE-19細胞增生的影響 將ARPE-19細胞以5×104/孔接種于96孔板，每孔接種100 μl，培養(yǎng)液為含有10%小牛血清的DMEM，待細胞長至 60%～70%融合狀態(tài)時，加入處理因素，每組重樓皂苷Ⅰ終濃度分別為0、0.75、1.5、3.0、6.0 μg/ml，每組均設6個平行孔，培養(yǎng)24 h后加入20 μl MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入 DMSO振蕩，調(diào)零，酶標儀570 nm波長處檢測光密度（optical density，OD）值，細胞生長抑制率（IR）=1-OD實驗組/OD空白對照組，實驗重復3次。

1.3Transwell實驗檢測重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞侵襲能力的影響 在上室膜表面均勻鋪培養(yǎng)基稀釋的Matrigel（1∶3），37℃培養(yǎng)箱中放置30 min，Matrigel凝固。再加入200 μl無血清懸浮培養(yǎng)基，輕洗水化基底膜后備用。取對數(shù)生長期的ARPE-19細胞常規(guī)消化后，加入終濃度為0、1.5、3.0、6.0 μg/ ml重樓皂苷Ⅰ，孵育1 h后，調(diào)整濃度為5×105個/ ml，取200 μl細胞懸液加入上室，另取200 μl含20%FBS的培養(yǎng)基放置于 Transwell下室內(nèi)，每組均設6個復孔，培養(yǎng)48 h后，取出小室，先棄去培養(yǎng)基，棉簽擦去位于上室的細胞，PBS漂洗2次，每孔加入10%甲醇溶液固定，再棄甲醇溶液，加入結(jié)晶紫染色，棄染色液，蒸餾水洗滌、干燥，顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)侵襲細胞數(shù)，實驗獨立重復3次。

1.4劃痕實驗檢測低氧對ARPE-19細胞遷移能力的影響 細胞培養(yǎng)，分組同1.3，取單層融合的ARPE-19細胞，用20 μl槍頭在細胞層上垂直劃線，PBS沖洗3次，去除劃下的細胞，培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細胞的遷移情況，軟件分析并計算平均劃痕愈合率。

1.5測定ERK1/2 mRNA表達水平 ARPE-19細胞培養(yǎng)，分組同1.3。設計上、下游引物，ERK1上游引物：5-GAACTCCAAGGGCTATACCAAGT-3，下游引物：5-GGAGGGCAGAGACTGTAGGTAGT-3，產(chǎn)物164 bp；ERK2上游引物：5′-TCCCCATCACAAGAAGACCT-3′，下游引物：5′-AGTCAGCATTTGGGAACAGC-3′，產(chǎn)物 106 bp；GAPDH上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物：5′-TGGAGGGATCTCGCTCCTGGAAGAT-3′，GAPDH擴增長度為214 bp。提取ARPE-19細胞總RNA；cDNA合成；取cDNA 1 μl，2.5×RealMasterMix/20×SYBR溶液11.25 μl，上下游引物各1 μl，加無Rnase水，總反應體積25 μl；PCR反應條件為：95℃變性2 min，循環(huán)95℃變性15 s，50℃退火30 s，68℃延伸50 s。結(jié)果采用ΔCt值法，ΔCt=樣品的Ct均值-內(nèi)參的Ct均值，2-ΔΔCt即某樣品初始cDNA的相對量。

1.6Western blot檢測 根據(jù)預實驗結(jié)果，加入不同濃度的重樓皂苷Ⅰ（終濃度依次為 0、1.5、3.0、6.0 μg/ml），每個濃度均設6孔。培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)后的 ARPE-19細胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜后加入一抗，4℃過夜；PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育0.5 h；洗膜；用增強化學發(fā)光試劑盒檢測。結(jié)果掃描后，用Quantity one圖像分析軟件光密度分析，以β-actin為內(nèi)參校正。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用重復測量設計的單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1MTT法檢測重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞的生長活性的影響 培養(yǎng)24 h后，6.0 μg/ml組（t= 23.317，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t=16.266，P= 0.000）、1.5 μg/ml組（t=8.012，P=0.000）與0.75 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義；3.0 μg/ ml組（t=8.442，P=0.000）、1.5 μg/ml組（t= 15.224，P=0.000）與6.0 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義。表明重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞的生長有抑制作用，其作用有濃度依賴性（F= 187.601，P=0.000）。見圖1。

圖1　MTT法檢測重樓皂苷Ⅰ對　ARPE-19細胞增殖的影響

2.2重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞侵襲能力的影響

培養(yǎng)48 h后，與空白對照組比較，6.0 μg/ml組（t =14.221，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t=8.754，P= 0.000）、1.5 μg/ml組（t=5.176，P=0.000）侵襲細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義；3.0 μg/ml組（t=7.537，P=0.000）、1.5 μg/ml組（t=11.507，P=0.000）與6.0 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義。表明重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞的侵襲能力有抑制作用，其作用呈濃度依賴性（F=75.733，P= 0.000）。見圖2。

圖2　重樓皂苷Ⅰ對　ARPE-19細胞侵襲能力的影響×40

2.3重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞遷移能力的影響培養(yǎng)48 h后，與空白對照組比較，6.0 μg/ml組（t =28.853，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t=18.804，P =0.000）、1.5 μg/ml組（t=10.860，P=0.000）劃痕愈合率差異均有統(tǒng)計學意義；3.0 μg/ml組（t= 8.089，P=0.000）、1.5 μg/ml組（t=18.269，P= 0.000）與6.0 μg/ml組抑制率比較差異均有統(tǒng)計學意義。表明重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞的遷移能力有抑制作用，其作用呈濃度依賴性（F=281.005，P=0.000）。見圖3。

2.4重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2 mRNA表達的影響 重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2 mRNA表達無明顯影響。與空白對照組比較，6.0 μg/ml組（t=2.127，P=0.059）、3.0 μg/ml組（t= 2.041，P=0.069）、1.5 μg/ml組（t=2.095，P= 0.063）重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1 mRNA表達無明顯影響。與空白對照組比較，6.0 μg/ml組（t=1.236，P=0.245）、3.0 μg/ml組（t=0.246，P=0.811）、1.5 μg/ml組（t=0.320，P=0.755）重樓皂苷Ⅰ對 ARPE-19細胞 ERK2 mRNA表達均無明顯影響。見圖4。

圖3　重樓皂苷Ⅰ對　ARPE-19細胞遷移能力的影響×40

2.5重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響 重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2蛋白表達無明顯影響，但對p-ERK1/2蛋白表達有明顯抑制作用。與空白對照組比較，6.0 μg/ml組（t=20.549，P=0.000）、3.0 μg/ml組（t= 15.386，P=0.000）和1.5 μg/ml組（t=8.647，P= 0.000）重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞p-ERK1/2蛋白表達有明顯抑制作用。與空白對照組比較，6.0 μg/ ml組（t=2.170，P=0.055）、3.0 μg/ml組（t= 0.447，P=0.664）和1.5 μg/ml組（t=0.935，P= 0.372）重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2蛋白表達無明顯影響。見圖5。

圖4　重樓皂苷Ⅰ對　ARPE-19細胞　ERK1/2 mRNA表達的影響

3　討論

PVR是多種細胞及細胞因子參與的對眼內(nèi)損傷的過度修復反應［7］。人RPE細胞的增生、遷移是PVR發(fā)病的早期組織病理學機制。RPE細胞在PVR的發(fā)展中起著決定性的作用。抑制RPE細胞遷移、增生是治療 PVR的方向之一。體外培養(yǎng)的RPE細胞（ARPE-19）有活體內(nèi)RPE細胞所特有的結(jié)構(gòu)和功能特點，可用于各種體外實驗［8］，因此本研究選擇ARPE-19細胞作為實驗對象。

隨著重樓皂苷Ⅰ增高，對ARPE-19細胞IR逐漸提高，提示重樓皂苷Ⅰ有抑制ARPE-19細胞增殖的活性。此外，通過劃痕試驗和Transwell試驗分別檢測了重樓皂苷Ⅰ對RPE細胞橫向和縱向遷移的影響。因為PVR的本質(zhì)是機體對損傷的過度修復。在PVR中，由于受到各種細胞因子的影響，視網(wǎng)膜色素上皮細胞除了水平方向運動外，縱向侵襲也是視網(wǎng)膜前、下增生膜形成的重要原因。結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ明顯抑制了ARPE-19細胞的侵襲和遷移。

圖5　重樓皂苷Ⅰ對　ARPE-19細胞　ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響

目前就重樓皂苷Ⅰ抑制ARPE-19細胞增殖、侵襲和遷移的機制還不清楚。重樓活性單體能通過抑制ERK的磷酸化抑制結(jié)腸癌SW620細胞的增殖［9］。ERK也被稱為絲裂原激活的MAPK通路，研究［10］顯示，只有磷酸化的ERK才可以進入細胞核內(nèi)，促進c-Fos與c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，參與ERK通路下游的一系列的激活反應。ERK主要參與細胞分化或增殖，促進細胞生存［11］，ERK1/2 MAPK通路阻斷可抑制胃癌、乳腺癌等細胞凋亡、促進細胞侵襲，并且抑制miR-21及其靶基因表達［12-14］。本研究檢測了不同濃度重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2 mRNA表達以及對ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響。結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ對ARPE-19細胞ERK1/2 mRNA表達以及對ERK1/2蛋白表達并無明顯影響。重樓皂苷Ⅰ可能主要通過下調(diào)ERK1/2磷酸化的程度，從而抑制了ARPE-19細胞增殖，侵襲和遷移。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示重樓皂苷Ⅰ能夠抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系ARPE-19增殖、遷移，這可能與其抑制ERK1/2的磷酸化有關。這為中藥重樓治療PVR提供了一定的依據(jù)。

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Effects of PolyphyllinⅠ on proliferation and migration of human retinal epithelial cells line ARPE-19

Su Feifei，Lu Mudi，Zeng Huihong，et al
（Dept of Ophthalmology，Hezhou Renmin Hospital，Hezhou 542899）

Objective To study the effects of PolyphyllinⅠ on the proliferation and migration of human retinal pigment epithelial cell ARPE-19.Methods MTT assay was performed to investigate the effect of Polyphyllin I on the proliferation of ARPE-19 cells.Invasion ability of ARPE-19 cells was determined by a Matrigel invasion assay. Migration ability of ARPE-19 cells was determined by a wound healing assay.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used to detect ERK1/2 mRNA expression.Western blot was used to detect the expression of ERK1/2，p-ERK1/2.Results PolyphyllinⅠinhibited proliferation of ARPE-19 cells in a dose dependent manner（P＜0.01）.PolyphyllinⅠtreatment reduced migration and invasion capacity of ARPE-19 cells （P＜0.01）.PolyphyllinⅠ treatment has no effect on the ERK1/2 mRNA and ERK1/2 protein expression in ARPE-19 cells，but p-ERK1/2 protein expression was markedly decreased by treatment with PolyphyllinⅠ（P＜0.01）.Conclusion PolyphyllinⅠcan effectively inhibit the ARPE-19 cells proliferation and migration，it may be related to inhibition of the phosphorylation of ERK1/2 in ARPE-19 cells.This study provides some evidences for the efficacy of paradis in the treatment of proliferative vitreoretinopathy.

PolyphyllinⅠ；proliferation；migration；retinal pigment epithelial cells

R 774.1

A

1000-1492（2016）07-0956-05

2015-04-13接收

湖北省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研指導性項目（編號：2013Z-B05）

1賀州市人民醫(yī)院眼科，賀州 5428992湖北省中醫(yī)院、湖北中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，武漢430061

蘇菲菲，女，碩士，責任作者，E-mail：984625812@qq.com