裂壺藻補糖發酵及糖氮代謝對產油的影響

付　杰,林源鋒,謝鑫磊,田　華,陳　濤,何東平,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.中國科學院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

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裂壺藻補糖發酵及糖氮代謝對產油的影響

付杰1,林源鋒1,謝鑫磊1,田華1,陳濤2,何東平1,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.中國科學院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

為了探索裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)突變株生長及產油過程中對碳源和氮源的需求,本文對發酵各階段的碳源和氮源利用變化情況進行測定,并設定五個在不同時期的補糖實驗組進行研究,分別觀測各組各時期生物量、油脂產量。結果表明,前96 h是裂壺藻生長的重要時期,生物量大幅度增長,在發酵144～168 h時,油脂產量達到最大,各組經發酵7 d收獲總的藻體,對生物量、油脂產量、DHA含量和DHA產量進行綜合測定,結果表明,在發酵120 h時進行補糖為最佳時期,且油脂產量及DHA產量相比于對照組分別高出18.80%和22.44%。當氮源耗盡時補糖不僅可以促進油脂的產生,而且對DHA的形成也是有利的。

裂壺藻突變株,營養代謝,補糖發酵

DHA具有防治心血管疾病,提高人體免疫力、預防和減輕精神疾病、消炎、抗癌等功能。1993年世界衛生組織正式推薦嬰幼兒生長發育早期階段要補充DHA后,DHA吸引了越來越多的關注[1-2],裂壺藻(Schizochytriumlimacinum)是一種海洋真菌,該菌富含DHA,油脂含量高、生長快、易于培養、對人畜無毒害,并且細胞內脂肪酸組成簡單、分離純化工藝簡單,是一種極具工業化生產前景的微生物油脂資源[3-4]。

裂壺藻在生長對數期之前主要利用碳源和氮源進行自身的生長繁殖和油脂積累,生長對數期之后若沒有及時的碳源補給,裂壺藻便會分解自身的油脂來提供生存所必需的能量[5]。因此,及時的補糖有利于裂壺藻油脂積累[6-7]。盧英華等[8]利用流加技術高密度培養裂壺藻生產DHA,生物量、脂肪酸及DHA含量分別達到60.6、40.2和8.0 g/L。De Swaaf等[9]報道,當發酵液中葡萄糖濃度過高會抑制菌體生長,只有當碳氮濃度適中,并且達到一個適合的碳氮比才有可能盡量的提高產油率和DHA含量。本文通過研究裂壺藻發酵過程中的碳氮含量的變化,通過每天對發酵液碳氮含量進行測定,并且觀測生物量、油脂產量及DHA產量,了解裂壺藻發酵過程中,碳氮代謝對產油的影響,并且通過對不同的培養時間補糖發酵,以期來增加油脂產量,從而為大規模生產化提供了必要的科學基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

裂壺藻株ATCC20888廣東微生物菌種保藏中心,并經過等離子誘變獲得的裂壺藻突變株15k-160s-2-3,本實驗室保存。葡萄糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉天津博迪化工股份有限公司;酵母膏北京奧博星生物技術有限責任公司;谷氨酸鈉上海如吉生物科技發展有限公司;硫酸鎂國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈷天津市恒興化學試劑制造有限公司;正己烷天津市科密歐化學試劑有限公司;磷酸二氫鉀、氯化鈣天津市凱通化學試劑有限公司;無水乙醇天津天力化學試劑有限公司;纖維素酶、堿性蛋白酶江蘇銳陽生物科技有限公司;實驗所用的試劑均為分析純。

Agilent 7890A氣相色譜儀安捷倫科技(中國)有限公司;SPX-150C恒溫恒濕箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠;HYQ-150S全溫搖床武漢匯誠生物科技有限公司;YM75立式壓力蒸汽滅菌器上海三申醫療器械有限公司;SW-CJ-1F 單人雙面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;XSP-BM-2CA生物顯微鏡寧波永新光學有限公司。

固體培養基:葡萄糖80 g/L、谷氨酸鈉18 g/L、酵母膏12 g/L、海水晶24 g/L、硫酸銨2.4 g/L、金屬離子混合液1 mL、維生素混合液2 mL、瓊脂2%。液體培養基:葡萄糖80 g/L、谷氨酸鈉18 g/L、酵母膏12 g/L、海水晶24 g/L、硫酸銨2.4 g/L、硫酸鈉6 g/L、磷酸二氫鉀5.76 g/L、金屬離子混合液1 mL、維生素混合液2 mL。

1.2實驗方法

1.2.1發酵補糖代謝設計設計五個實驗組分別在發酵24、48、72、96、120 h時補15 g/L糖和一個不補糖發酵的對照組,并且五個實驗組和對照組初始葡萄糖質量濃度均為80 g/L,每24 h檢測各組糖、氮利用情況,并收獲藻體,分別測定各階段產油量。最后對整個發酵周期完全的各組進行生物量、產油量、DHA含量及DHA產量的整體測定。

1.2.2無菌培養條件種子培養:從無菌長勢良好的藻種的斜面上取一定量純凈的藻落,用無菌破口試管取10%接種到種子培養液中,置于搖床上,pH6.5,26 ℃、180 r/min條件下培養。

發酵培養:用滅過菌的破頭吸管吸取10%的種子液,轉接于發酵培養基中,于26 ℃、180 r/min的條件下振蕩培養。

1.2.3還原糖質量濃度的測定參照菲林試劑法[10]

1.2.4氨基酸質量濃度的測定參照甲醛滴定法[11]

1.2.5生物量的測定裂壺藻的生物量以收集的菌體細胞干質量計。取培養好的菌體發酵液100 mL預先稱重的離心管中5000 r/min離心20 min,棄上清液,沉淀用蒸餾水清洗后再次離心、棄上清液,反復操作3次,置于干燥箱中,60 ℃條件下烘干至質量恒定,稱質量。生物量的計算公式如下:

1.2.6油脂的提取及產量測定油脂的提取:將裂壺藻發酵液經過離心分離,去除上清液,在藻泥中加入一定量的蒸餾水混合均勻,置于恒溫磁力攪拌器中,溫度60 ℃下攪拌,調節pH到8左右,按發酵液質量體積的0.5%和0.025%分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶,55 ℃酶解6～8 h,用顯微鏡觀察破壁情況,破壁完成置于真空冷凍干燥至質量恒定,研磨成藻粉,用乙醚索氏抽提至藻粉至無色,旋轉蒸發殘留溶劑,置于烘箱干燥至兩次質量變化<0.2 mg/L,計算油脂質量。油脂產量及含油率的計算公式如下:

1.2.7DHA含量測定

1.2.7.1待測樣品的處理精密稱取0.2 g的油脂于20 mL試管中,加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液2 mL,60 ℃水浴加熱至油珠完全溶解(約30 min),冷卻后加入25%的BF3-CH3OH 溶液2 mL,60 ℃水浴酯化20 min。冷卻后加入2 mL正己烷并振蕩,再加入2 mL飽和NaCl溶液并振蕩。靜置30 min后取上層有機相于一只干燥試管中,并加入少量無水硫酸鈉以去除微量水分,經氣相色譜分析得到DHA相對含量。

DHA產量計算公式如下:

DHA產量(g/L)=油脂產量(g/L)×DHA含量(%)

1.2.7.2氣相色譜分析條件色譜柱:Agilent SP-2560(100 m×25 μm,0.2 μm);升溫程序:100 ℃保持4 min,以3 ℃/min升溫至230 ℃,保持20 min,載氣(N2)流速25 mL/min,壓力2.4 kPa,進樣量1 μL;分流比15∶1。

2　結果與分析

2.1裂壺藻突變株對碳、氮的利用變化及不同時期的補糖對產油的影響

裂壺藻突變株對碳、氮利用的變化及補糖發酵對產油的影響的情況見圖1～圖6,圖1為A組對照組,圖2～圖6為B、C、D、E、F組分別為發酵24、48、72、96、120 h時補15 g/L糖組,將對照組和各實驗組發酵培養7 d,每隔24 h用斐林試劑法和甲醛滴定法對各組各時刻的碳、氮變化進行測定,并計算碳、氮消耗情況、碳氮比,確定生物量及油脂產量。首先測定了每組實驗初始葡萄糖和氨基酸質量濃度將近為80.92 g/L和14.86 g/L,其次在各組分別補糖,補糖組在補糖時刻,糖的含量都高于其他各組,當發酵144 h以后測定A、B、C、D、E、F組葡萄糖和氨基酸質量濃度基本不變。最后在發酵168 h后收獲藻體,測定各組總的生物量、油脂產量、DHA含量、DHA產量,進行綜合對比。

從圖1首先看出對照組A前96 h糖耗為86.76%左右,氮耗為92.92%左右;說明前96 h是裂壺藻利用營養物質的主要時期,96 h后碳源和氮源消耗趨于穩定;其次前96 h糖耗的速率先慢后快,而氮耗的速率則是先快后慢,表明裂壺藻突變株前期較快利用氮源進行營養生長。并且前96 h生物量大幅度增長,說明前96 h為裂壺藻快速增長期,96 h之后生物量增長比例變小,而油脂產量增長比例逐漸增大。在144 h達到產量最大值,說明裂壺藻在發酵后期為產油脂重要時期。當168 h收獲時發酵液中剩余殘糖質量濃度僅8.62 g/L,氨基酸質量濃度為1.02 g/L,碳/氮質量濃度(g/L)比約為8.5∶1。

圖1　對照組A碳、氮利用變化Fig.1　Contrast group A changes of the use of sugar and nitrogen

從圖2看出實驗組B與對照組A相比氨基酸質量濃度曲線基本不變,還原糖質量濃度曲線在24 h時略有上升;96 h后趨于穩定,此時糖耗為86.13%左右,氮耗為92.60%左右;在前48 h生物量及油脂產量相比于對照組有所下降,可能是因為發酵24 h補糖后,糖濃度過高對裂壺藻生長有一定的抑制作用。當168 h放瓶收獲時發酵液中剩余殘糖質量濃度僅8.52 g/L,氨基酸質量濃度為1.04 g/L,碳/氮質量濃度(g/L)比約為8.2∶1。

圖2　實驗組B碳、氮利用變化Fig.2　Test group B changes of the use of carbon and nitrogen

從圖3看出實驗組C與對照組A相比氨基酸質量濃度曲線基本不變,還原糖質量濃度曲線在48 h時略有上升;96 h后趨于穩定,此時糖耗為86.51%左右,氮耗為90.71%左右;生物量和油脂產量相比于對照組A、B都有小幅度的提高。當168 h放瓶收獲時發酵液中剩余殘糖質量濃度僅8.28 g/L,氨基酸質量濃度為1.28 g/L,碳/氮質量濃度(g/L)比約為6.5∶1。

圖3　實驗組C碳、氮利用變化Fig.3　Test group C changes of the use of carbon and nitrogen

從圖4看出實驗組D與對照組A相比氨基酸質量濃度曲線基本不變,還原糖質量濃度曲線在72 h時略有上升;96 h后趨于穩定,此時糖耗為87.33%左右,氮耗為91.39%左右;生物量和油脂產量相比于對照組A、B、C都有一定幅度的提高。當168 h放瓶收獲時發酵液中剩余殘糖質量濃度僅8.32 g/L,氨基酸質量濃度為1.29 g/L,碳/氮質量濃度(g/L)比約為6.5∶1。

圖4　實驗組D碳、氮利用變化Fig.4　Test group D changes of the use of carbon and nitrogen

從圖5看出實驗組E與對照組A相比氨基酸質量濃度曲線基本不變,還原糖質量濃度曲線在96 h時略有上升;前72 h糖耗為52.81%左右,氮耗為85.24%左右;當96 h補15 g時時,發酵液中殘糖濃度為47.19%左右,氨基酸濃度為9.89%左右;生物量相比于對照組A沒有太大增長,而油脂產量相比于A、B、C、D組卻有一定幅度提高,說明發酵中后期補糖對裂壺藻產油脂有比較大的影響。當168 h放瓶收獲時發酵液中剩余殘糖質量濃度僅8.46 g/L,氨基酸質量濃度為1.05 g/L,碳/氮質量濃度(g/L)比約為8∶1。

表1　對照組和實驗組的生物量、油脂產量、DHA產量及含量Table 1　The Biomass,oil production,DHA production and content of contraet group and test group

圖5　實驗組E碳、氮利用變化Fig.5　Test group E changes of the use of carbon and nitrogen

從圖6看出實驗組F與對照組A相比氨基酸質量濃度曲線基本不變,還原糖質量濃度曲線在120 h時略有上升;前96 h糖耗為84.37%左右,氮耗為92.02%左右;當120 h補糖15 g時,發酵液中殘糖濃度為29.16%左右,氨基酸濃度為7.70%左右;圖中可以看出F組生物量、油脂產量相比于其他各組都有相當程度的提高,說明在發酵后期補充一定量的碳源對于裂壺藻產油是非常有利的。當168 h放瓶收獲時發酵液中剩余殘糖質量濃度僅8.70 g/L,氨基酸質量濃度為1.10 g/L,碳/氮質量濃度(g/L)比約為8∶1。

圖6　實驗組F碳、氮利用變化Fig.6　Test group F changes of the use of carbon and nitrogen

2.2補糖發酵對裂壺藻突變株干重、產油率及DHA的影響

將對照組及實驗組發酵7 d后,對它們的生物量、油脂產量、及DHA產量及含量進行綜合測定,得出表1。

從表1中可以看出,實驗組B、C、D、E、F中生物量、油脂產量、DHA產量、DHA含量多數都高于對照組A,尤其是實驗組F油脂產量及DHA產量相比于對照組A分別高出18.80%和22.44%。

3　結果與討論

本文通過對裂壺藻糖、氮代謝變化進行觀測,得出前96 h是裂壺藻生長的重要時期,隨著發酵的不斷進行,碳/氮比會一直下降。當對照組發酵至120 h時,發酵液中碳/氮比約為7∶1,此時補糖的F組生物量、油脂產量DHA產量及含量都達到本實驗最高。從補糖角度來分析,五個不同的補糖實驗組油脂的生物量、油脂產量、DHA產量及含量多數高于對照組。盧英華等通過流加培養裂壺藻表明,當裂壺藻受到氮源的限制,油脂濃度成指數增長。說明油脂的積累是在細胞生長受限的條件下進行的,細胞不會消耗自身合成的油脂;在線性生長時,營養限制使得細胞生長受限因此產生更多的油脂,并且充足的營養供給可能導致更多的飽和脂肪酸合成,相反氮源的限制可能使得更多的不飽和脂肪酸形成。本實驗結果也表明當氮源耗盡時補糖不僅可以促進油脂的產生,而且對DHA的形成也是有利的。

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Effect of oligosaccharide-adding fermentation and sugar-nitrogen metabolism onSchizochytriumlimacinumproducing oil

FU Jie1,LIN Yuan-Feng1,XIE Xin-lei1,TIAN Hua1,CHEN Tao2,HE Dong-ping1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Wuhan Institute of Virus,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

In order to explore the requirement of sugar and nitrogen sources in the vegetative growth and oil production of limacinumSchizochytriummutant strain,this study determined the change of carbon source and nitrogen source at different fermention stages,and the experimental groups oligosaccharide-adding were set up at five different periods,and the biomass and oil production of each group were measured.The research showed that the first 96 h was the important period of the limacinumSchizochytriumgrowth,and the biomass increased rapidly.When it was fermented for 144～168 h,the oil yield reached at the maximum value.The total biomass,lipid production,DHA content and DHA production were comprehensively measured after fermenting for 7 d.The result showed that it was the optimal time to adding oligosaccharide when fermented for 120 h,and the yield of oil and DHA were increased by 18.80% and 22.44% compared with the control group.When the nitrogen source was depleted,oligosaccharide supplement can not only promote the production of oil,but also benefit the formation of DHA.

Schizochytriumlimacinummutant strain;nutrient metabolism;oligosaccharide supplement fermentation

2015-10-16

付杰(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:微生物油脂，E-mail：2683802254@qq.com。

何東平(1957-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白，E-mail：hedp123456@163.com。

國家糧食局糧食公益性行業科研專項(201313012-03)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.026