肝癌大鼠瘤組織中Bsep基因的表達(dá)變化

王潔萍，張孟瑜，李波，夏先明（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

·基礎(chǔ)研究·

肝癌大鼠瘤組織中Bsep基因的表達(dá)變化

王潔萍，張孟瑜，李波，夏先明
（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

目的 觀察肝癌大鼠瘤組織中膽鹽輸出泵（Bsep）基因的表達(dá)變化。方法 取Wistar大鼠70只，隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組各35只，對(duì)照組予普通飲食，觀察組予二乙基亞硝胺飲食。20周后觀察組死亡2只，對(duì)照組未出現(xiàn)死亡病例。經(jīng)病理檢查證實(shí)觀察組肝癌模型建立成功，建模成功大鼠膽管內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的泥沙樣結(jié)石。取對(duì)照組肝臟組織和觀察組肝臟腫瘤組織，采用自動(dòng)生化儀檢測(cè)兩組膽管內(nèi)膽汁中膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)對(duì)照組肝臟組織和觀察組肝臟腫瘤組織中Bsep基因表達(dá)強(qiáng)度。石蠟切片后用免疫組化SP法檢測(cè)對(duì)照組肝臟組織和觀察組肝臟腫瘤組織中Bsep蛋白表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果 觀察組膽汁中TBA、TC、DBIL水平明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05），對(duì)照組、觀察組Bsep基因相對(duì)表達(dá)量分別為8±0.5、31±1.3，兩組比較，P＜0.05；對(duì)照組、觀察組肝臟組織中Bsep蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為68.2%、17.5%，兩組比較，P＜0.05。結(jié)論 肝癌大鼠肝臟腫瘤組織中Bsep基因表達(dá)明顯減少。

肝腫瘤；膽鹽輸出泵基因；大鼠

近年來(lái)，肝癌發(fā)病率逐漸增加，首選手術(shù)切除，但部分無(wú)法行根治性切除的患者僅能行姑息性切除，5年生存率較低。對(duì)無(wú)法進(jìn)行手術(shù)或放棄手術(shù)的患者，包括存在身體各器官?lài)?yán)重功能障礙，腫瘤侵及周?chē)M織或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，因自身?xiàng)l件有限放棄手術(shù)者等，進(jìn)行放療、化療、射頻消融等非手術(shù)治療后發(fā)現(xiàn)效果有限?；蛑委熓悄壳把芯康臒狳c(diǎn)，膽鹽輸出泵（Bsep）基因與膽汁酸分泌關(guān)系密切［1］，如Bsep功能紊亂，則可能引起膽汁酸淤積；而膽汁酸如果淤積，則可能形成結(jié)石，進(jìn)而可能導(dǎo)致肝臟組織的惡變。2015年1～8月，我們觀察了Bsep基因在肝癌大鼠瘤組織中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量（160±8）g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。主要試劑包括Real-time PCR定量試劑盒、Bsep單克隆抗體等。主要儀器包括ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，冰凍切片機(jī)，HFsafe生物安全柜，顯微攝像系統(tǒng)（PM-10A）等。

1.2 肝癌模型制備及分組 將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與觀察組各35只，對(duì)照組予以普通飲食，實(shí)驗(yàn)組予以含二乙基亞硝胺（DEN）飲食，連續(xù)20周后觀察組改為自由進(jìn)食，對(duì)照組自由飲水及進(jìn)食。每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食狀況及皮毛的變化等。于實(shí)驗(yàn)第8、16、20周，分別取出模型組動(dòng)物各2只，剖腹觀察肝臟情況，記錄肝臟的形態(tài)質(zhì)地等變化，20周后觀察組死亡2只。對(duì)照組大鼠飲食及生長(zhǎng)較好，未出現(xiàn)死亡病例。經(jīng)病理檢查證實(shí)觀察組肝癌模型建立成功，均為肝細(xì)胞性肝癌，腫瘤組織主要集中在右肝，約18.5%大鼠左肝部分組織亦出現(xiàn)腫瘤。

1.3 膽管內(nèi)膽汁中膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）測(cè)定 采用頭皮針插入膽管內(nèi)提取膽汁0.8～1 mL。采用自動(dòng)生化儀檢測(cè)兩組膽管內(nèi)膽汁中TC、TBA、TBIL、DBIL。

1.4 Bsep基因表達(dá)檢測(cè) 取對(duì)照組肝臟組織和觀察組肝臟腫瘤組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝臟組織和肝臟腫瘤組織中Bsep基因表達(dá)強(qiáng)度。肝臟組織及肝臟腫瘤組織中RNA的提取參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。序列擴(kuò)增機(jī)器為ABI7500，以GAPDH為內(nèi)參照。設(shè)計(jì)Bsep上游引物5′-CCCTCAACTGATGGGGGCTCCAGT-3′，下游引物3′-CCCATGTCTGACTCAGTGATTCTT-5′；GAPDH上游引物5′-GATGGTGGGTATGGGTCAGAA-3′，下游引物3′-CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-5′。使用2-ΔΔCt表示Bsep基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Bsep蛋白表達(dá)檢測(cè) 石蠟切片后用免疫組化SP法檢測(cè)肝臟組織和肝臟腫瘤組織中Bsep蛋白表達(dá)強(qiáng)度。肝臟組織及肝臟腫瘤組織中Bsep蛋白出現(xiàn)黃色染色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)觀察80個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞≥10%為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組膽管內(nèi)膽汁中TC、TBA、TBIL、DBIL水平比較 見(jiàn)表1。建模成功大鼠膽管內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的泥沙樣結(jié)石。

表1 兩組膽管內(nèi)膽汁中TC、TBA、TBIL、DBIL水平比較（±s）

表1 兩組膽管內(nèi)膽汁中TC、TBA、TBIL、DBIL水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別nTC（mmol/L）TBA（μmol/L）TBIL（μmol/L）DBIL（μmol/L）觀察組355.87±0.13*4.57±0.06*3.80±0.031.82±0.03*對(duì)照組352.38±0.111.65±0.033.73±0.050.58±0.05

2.2 兩組Bsep基因表達(dá)比較 觀察組與對(duì)照組Bsep基因相對(duì)表達(dá)量分別為8±0.5、31±1.3，兩組比較，P＜0.05（t=2.319）。

2.3 兩組Bsep蛋白表達(dá)比較 觀察組Bsep蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為17.5%，對(duì)照組Bsep蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為68.2%，兩組比較，P＜0.05（χ2=10.19）。

3 討論

肝癌是消化系統(tǒng)中惡性程度較高的腫瘤之一，目前其病因、發(fā)病機(jī)制等尚不完全明確，考慮其發(fā)病是各種因素綜合作用的結(jié)果，中間可能涉及一系列受體及介質(zhì)等的改變。目前普遍認(rèn)為，乙型、丙型肝炎病毒感染、亞硝胺類(lèi)物質(zhì)等與肝癌發(fā)病相關(guān)，但如何變化并不明確。由于肝癌可能是各種因素疊加而出現(xiàn)的結(jié)果，所以治療棘手。早期肝癌可行根治性手術(shù)切除，但如腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，則不能首選手術(shù)，而微波治療、冷凍治療、化療、放療等治療效果有限，復(fù)發(fā)率較高。基因治療是一種尚未廣泛用于臨床的治療方案，可能會(huì)使更多的肝癌患者獲益［2，3］。

Bsep是ATP結(jié)合盒超家族蛋白的一員，是一種依賴(lài)于ATP的膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)，在肝臟中Bsep主要表達(dá)于肝毛細(xì)膽管膜側(cè)，對(duì)膽汁酸的分泌、維持膽汁酸鹽濃度的穩(wěn)定有重要作用［4～6］，在膽汁酸鹽的腸肝循環(huán)中，肝細(xì)胞首先合成膽汁酸，接下來(lái)膽汁酸在Bsep作用下主動(dòng)分泌后轉(zhuǎn)運(yùn)至腸道，而當(dāng)膽汁酸進(jìn)入腸道后，結(jié)合膽汁酸在回腸通過(guò)一系列介質(zhì)，包括小腸刷狀緣鈉鹽依賴(lài)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，細(xì)胞內(nèi)膽汁酸結(jié)合蛋白和基側(cè)膜的終末腔面鈉鹽依賴(lài)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，最終重吸收入門(mén)靜脈，完成膽汁酸的腸肝循環(huán)。而如果Bsep功能紊亂導(dǎo)致膽汁排泄障礙，則可能出現(xiàn)肝內(nèi)膽汁淤積［7，8］，而由于膽汁淤積，則可能出現(xiàn)膽固醇、膽色素沉積，從而形成結(jié)石，而肝內(nèi)膽管結(jié)石的長(zhǎng)期存在，反復(fù)刺激膽管周?chē)M織產(chǎn)生炎癥，進(jìn)而可能引起肝細(xì)胞的惡變。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，觀察組膽汁中TBA、TC、DBIL水平明顯高于對(duì)照組，對(duì)照組肝臟組織中Bsep基因相對(duì)表達(dá)量約為觀察組的3.87倍，肝臟組織中Bsep蛋白陽(yáng)性表達(dá)率約為觀察組的3.89倍，證實(shí)肝癌大鼠肝臟腫瘤組織中Bsep基因出現(xiàn)明顯變化，說(shuō)明觀察組肝臟腫瘤組織中膽汁酸的分泌及重吸收開(kāi)始紊亂，隨Bsep基因表達(dá)的減少，膽汁酸在膽管內(nèi)大量積聚［9，10］；由此我們初步考慮在正常生理狀態(tài)時(shí)如果膽汁酸增加，則會(huì)伴隨Bsep基因表達(dá)增強(qiáng)，從而加快膽汁酸的排泄，減少膽汁酸的重吸收，降低膽管內(nèi)膽汁酸的濃度，避免過(guò)高濃度膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞的損害；而肝癌時(shí)則出現(xiàn)了膽汁酸的代謝障礙，隨著B(niǎo)sep基因表達(dá)的減弱，在肝內(nèi)出現(xiàn)大量膽汁酸淤積，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇和膽色素的沉積，形成結(jié)石，刺激膽管周?chē)M織產(chǎn)生炎癥，肝細(xì)胞反復(fù)出現(xiàn)破壞及增生，進(jìn)一步可能導(dǎo)致肝臟細(xì)胞發(fā)生惡變［11，12］。今后我們會(huì)在此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒒A(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行Bsep基因增強(qiáng)表達(dá)、Bsep基因敲除、多種藥物干預(yù)等實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤大小和數(shù)量的變化情況。在目前所用治療肝癌的藥物數(shù)量及品種稀少，其次普遍存在各種各樣的問(wèn)題，可能無(wú)法完全達(dá)到治療目的、服用時(shí)間較長(zhǎng)、肝腎功能損害大、對(duì)胃腸道刺激大，患者可持續(xù)接受治療性差等缺點(diǎn)，上述情況阻礙了其作為臨床治療藥物的廣泛應(yīng)用，但目前尚無(wú)可直接作用于肝癌相關(guān)基因又可產(chǎn)生較好療效的藥物。因此，Bsep基因基因表達(dá)變化的發(fā)現(xiàn)，可能為基礎(chǔ)研究和臨床治療肝癌提供了新方向［13，14］。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.008

R735.7

A

1002-266X（2016）25-0028-03

瀘州市科學(xué)技術(shù)局課題（2013-s-48）。

夏先明（E-mail：xxm6206@126.com）

2015-11-15）