原發(fā)性肝細胞癌組織中Syntaxin 8表達變化及意義

許新征，高福洋，黃淑紅，張化玉（承德市中心醫(yī)院，河北承德067000；山東大學醫(yī)學院）

·臨床研究·

原發(fā)性肝細胞癌組織中Syntaxin 8表達變化及意義

許新征1，高福洋1，黃淑紅2，張化玉1
（1承德市中心醫(yī)院，河北承德067000；2山東大學醫(yī)學院）

目的 觀察突觸融合蛋白8（Synatxin 8）在原發(fā)性肝細胞癌（HCC）組織中的表達變化，并探討其意義。方法 收集75例HCC患者術后肝癌組織及其對應癌旁肝硬化組織，采用組織芯片免疫組織化學染色及Western blotting方法檢測Syntaxin 8蛋白表達，分析Syntaxin 8蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系。結果 HCC組織中Syntaxin 8蛋白表達較癌旁肝硬化組織明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Syntaxin 8蛋白表達與HCC患者的性別、年齡無關，而與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移有關（P均＜0.05）。結論 Syntaxin 8蛋白在HCC組織中呈低表達，Synatxin 8可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展。

肝腫瘤；原發(fā)性肝細胞癌；肝癌組織；突觸融合蛋白8；腫瘤分化程度

原發(fā)性肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率和病死率均較高，其中70%～85%屬于原發(fā)性肝細胞癌（HCC）［1］。HCC誘因復雜，起病隱匿，發(fā)展迅速，且極易轉移和復發(fā)，這些特點是影響其術后治療效果和預后的最大障礙［2］。了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找HCC特異性分子標志物，對于HCC的診療有重要意義。越來越多的研究表明可溶性N-己基順丁烯二酰亞胺敏感因子（NSF）附著蛋白受體（SNARE）蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉移中發(fā)揮重要作用，并作為腫瘤的治療靶點受到越來越多重視［3～5］。突觸融合蛋白8（Synatxin 8）屬于SNARE家族中Syntaxin亞家族的成員之一，在胞內囊泡運輸及膜融合過程中發(fā)揮重要作用［6～8］。2008 年5月～2014年12月，我們采用組織芯片免疫組織化學染色及Western blotting方法檢測75例HCC組織中Syntaxin 8蛋白表達，分析Syntaxin 8蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 75例HCC患者，均經術后病理檢查證實診斷，男62例、女13例，年齡34～73歲，中位年齡56歲，其中≥60歲18例，＜60歲57例。淋巴結轉移4例。患者均行肝部分切除術，術中分別切取非壞死區(qū)肝癌組織（肝癌組織）及距腫瘤邊緣至少2 cm肝硬化組織（癌旁組織），體積約0.5 cm ×0.5 cm×0.5 cm。組織塊經脫水、包埋、切片后制成組織切片。

1.2 Syntaxin 8蛋白在肝癌組織及癌旁肝臟組織中的表達檢測 ①免疫組織化學染色法：60℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90℃微波抗原修復8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；Syntaxin 8鼠抗人一抗1∶200稀釋后室溫孵育1 h后4℃過夜；聚合物增強劑室溫孵育20 min，酶標抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規(guī)DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照組，同時作空白對照。根據陽性、陰性和空白對照的顯色情況，在排除假陽性和假陰性的前提下，計數每例份腫瘤組織中的所有腫瘤細胞，當＞10%細胞著色判斷為表達陽性，且以細胞膜或細胞質染成棕黃為弱陽性判定標準，棕褐色為強陽性判定標準［9］。②Western blotting法：為進一步證實免疫組織化學染色的結果，選取8例樣本對Syntaxin 8蛋白表達進行檢測。取新鮮冰凍肝癌組織和癌旁組織按照重量體積比1∶3加入組織裂解液（Tris-Cl 10 mmol/L，pH 8.0，NaCl 150 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，1%NP-40，10%甘油及蛋白酶抑制劑）進行裂解，BCA法測定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取組織總蛋白50 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：32 mA，60 min；轉膜：110 V，120 min，將凝膠上的蛋白濕轉至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉1 h后，抗Syntaxin 8（1∶1 000）及抗β-tubulin （1∶20 000）抗體室溫孵育1 h；TBST漂洗后，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h；TBST漂洗后電化學發(fā)光法檢測Syntaxin 8蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數資料比較進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Syntaxin 8蛋白在肝癌組織及癌旁肝臟組織中的表達比較 Syntaxin 8蛋白定位于肝細胞胞質及核周，呈棕色顆粒狀，彌漫或灶性分布；肝癌組織及癌旁肝臟組織均能被染色，只是肝癌組織中癌細胞染色為淺棕色，而癌旁肝臟組織肝細胞呈深棕色，提示肝癌組織中Syntaxin 8蛋白表達量低于癌旁組織（圖1）。與癌旁組織相比48%（36/75）肝癌組織有不同程度的Syntaxin 8基因表達水平下調。Western blotting結果顯示，Syntaxin 8蛋白在癌旁肝臟組織及肝癌組織中陽性表達率分別為77.3%、29.3%，二者比較，P＜0.05。

圖1 Syntaxin 8蛋白在人肝癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 Syntaxin 8蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系 肝癌組織中Syntaxin 8蛋白表達與HCC患者腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移有關（P均＜0.05），見表1。

表1 Syntaxin 8蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系

3 討論

Syntaxin 8在多種組織中均有表達，如心臟、腦、脾、肺、腎、肝等［10］。在胞內其主要定位于高爾基體、內體和溶酶體的膜組分中，作為SNARE成員，在物質運輸和膜融合過程中發(fā)揮重要作用［9，11］。研究表明Syntaxin 8與其他三個SNARE成員Syntaxin 7、vti1b或vti1a及VAMP7或VAMP8在膜融合過程中形成復合物促進晚期內體之間的同源融合及晚期內體與溶酶體間的融合，從而促進蛋白的降解過程［11］。Syntaxin 8還參與到某些離子通道或受體的胞內運輸過程進而影響細胞的生物學功能，如氯離子通道囊性纖維化跨膜轉導調節(jié)器CFTR及神經生長因子受體TrkA等［12～14］。

我們通過免疫組織化學染色及Western blotting方法檢測到Syntaxin 8蛋白在HCC患者肝癌組織中表達水平較癌旁組織明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。通過分析Syntaxin 8蛋白表達水平與HCC患者臨床病理特征的關系，我們發(fā)現Syntaxin 8蛋白表達與患者年齡、性別無關，但與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移有關，且腫瘤越大，TNM分期越晚，存在淋巴結轉移，則Syntaxin 8蛋白表達下調越明顯；即Syntaxin 8蛋白與HCC的預后有關，Syntaxin 8蛋白表達越高，腫瘤越小、TNM分期越早、淋巴結轉移越少。提示Syntaxin 8蛋白作為抑癌因子在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤生長、減少腫瘤轉移的作用。

研究［4］發(fā)現SNARE成員在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其中Syntaxin 8被發(fā)現在膠質母細胞瘤中與抑癌基因Mig-6結合，通過影響表皮生長因子受體EFGR內吞后的轉運及其降解過程，從而影響EGFR介導的促腫瘤信號［15］，而EGFR被報道能促進HCC的發(fā)生發(fā)展過程［16］，因此Syntaxin 8 在HCC中可能通過促進EGFR的降解過程發(fā)揮其抑癌機制。除此之外，Syntaxin 8亦可通過參與其他癌基因的降解過程或其他癌基因或抑癌基因的胞內運輸過程來影響這些基因生物學功能的發(fā)揮，從而達到抑癌效果，而Syntaxin 8的具體抑癌機制有待進一步研究證實。

綜上所述，肝癌組織中低表達Syntaxin 8蛋白能明顯促進肝癌細胞的生長，這在HCC基因治療中有一定臨床應用前景。Syntaxin 8蛋白可能通過促進EGFR的降解抑制肝癌的發(fā)生，但在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制尚有待進一步研究。

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2015-12-31）