西瓜回交世代酸味株系基因型分析

高 磊，趙勝杰，路緒強(qiáng)，何 楠，朱紅菊，豆峻嶺，張 莉，劉文革

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.&Na?kai]是一年生蔓性草本植物，屬于葫蘆科西瓜屬。因其營養(yǎng)豐富，味甜多汁，是夏季消暑解渴的佳品，有夏季“水果之王”的美譽(yù)，在世界園藝產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織2014年統(tǒng)計(jì)，世界上西瓜的種植面積達(dá)到了蔬菜種植面積的9.5%。

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)西瓜的品質(zhì)提出了更高要求，因此培育優(yōu)質(zhì)的西瓜品種，滿足人們的消費(fèi)需求就顯得尤為重要。西瓜果實(shí)品質(zhì)主要包括商品品質(zhì)、感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等方面。有機(jī)酸的組分與含量是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素，對(duì)果實(shí)的營養(yǎng)品質(zhì)和代謝起重要作用［1-2］。同時(shí)有機(jī)酸對(duì)人體有重要的營養(yǎng)價(jià)值，蘋果酸具有天然香味，口味柔和，有利于人體氨基酸吸收；而檸檬酸則具有溫和爽快的酸味，可以增進(jìn)食欲，并促進(jìn)體內(nèi)對(duì)鈣、磷的吸收。隨著人們生活習(xí)慣的改變，不同的消費(fèi)者對(duì)酸甜口味有不同的偏好，當(dāng)果實(shí)的含糖量較高時(shí)，酸含量較高的果實(shí)更受喜愛［3］。新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心已成功培育出一系列酸甜可口的風(fēng)味甜瓜品種，具有廣闊的應(yīng)用前景［4］。而目前種植的西瓜作物基本上是以甜味為主的品種，具有酸甜口味的西瓜品種尚處于市場上的空白期，因此培育酸甜可口的西瓜新品種，來彌補(bǔ)市場空缺，調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，就成為擺在西瓜育種家面前的一項(xiàng)重要任務(wù)。要達(dá)到這一目的，首先就需要了解西瓜果實(shí)有機(jī)酸含量形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。

果實(shí)有機(jī)酸含量是復(fù)雜的數(shù)量性狀，主要受遺傳因素的控制，同時(shí)受自然環(huán)境和栽培措施等因素的共同影響。甜瓜果實(shí)中的有機(jī)酸主要以檸檬酸為主，還含有蘋果酸、琥珀酸等［5］。張紅［6］研究認(rèn)為甜瓜果實(shí)總酸含量和酸度（pH）受一對(duì)主基因+多基因混合遺傳模型控制，而檸檬酸含量則主要受兩對(duì)主基因+多基因混合遺傳模型控制。針對(duì)西瓜果實(shí)中有機(jī)酸相關(guān)方面的研究不多，主要集中在成熟西瓜果實(shí)中有機(jī)酸的種類和含量，且結(jié)果也不一致。西瓜成熟果實(shí)中的有機(jī)酸含量總體偏少，主要成分是蘋果酸和檸檬酸，同時(shí)還含有少量的甲酸［7］。也有研究者認(rèn)為成熟西瓜果實(shí)中的有機(jī)酸主要是蘋果酸和檸檬酸，還有微量的琥珀酸和富馬酸［8-9］。同時(shí)又有研究者認(rèn)為西瓜果實(shí)中的有機(jī)酸主要是蘋果酸和酒石酸［10-11］。因此可將西瓜歸結(jié)為蘋果酸積累型果實(shí)。

由于受西瓜種質(zhì)資源的利用限制，使得對(duì)西瓜果實(shí)有機(jī)酸的研究較少，因此尚未見到與西瓜果實(shí)有機(jī)酸相關(guān)的分子生物學(xué)方面的報(bào)道。本試驗(yàn)通過連續(xù)多代回交和SSR分子標(biāo)記研究對(duì)BC7F1世代進(jìn)行果實(shí)酸味株系基因型分析，所獲得的與有機(jī)酸含量相關(guān)的導(dǎo)入系群體，其酸味能穩(wěn)定遺傳，是研究有機(jī)酸合成復(fù)雜性狀的良好材料，為有機(jī)酸合成途徑關(guān)鍵基因的精細(xì)定位和克隆奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也豐富了西瓜的種質(zhì)資源類型，有助于選育酸甜風(fēng)味的西瓜新品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料及群體構(gòu)建

試驗(yàn)材料‘203Z’為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所多倍體西瓜課題組經(jīng)過多代自交的西瓜栽培品系（C.lanatus ssp.vulgaris），果實(shí)中心可溶性固形物含量11.5%左右，pH值6.5左右；‘PI 271769’為非洲野生西瓜（C.lanatus ssp.lanatus），果實(shí)中心可溶性固形物含量4.0%左右，pH值4.6左右。以‘203Z’為母本、‘PI 271769’為父本雜交獲得 F1代，再以‘203Z’為輪回親本，經(jīng)過7代連續(xù)回交，在BC7F1世代發(fā)現(xiàn)了果實(shí)具有酸味的西瓜株系。田間試驗(yàn)于2011年3月至2015年7月在河南省中牟縣和新鄉(xiāng)縣試驗(yàn)基地進(jìn)行。除野生西瓜外，所有試驗(yàn)材料均以‘新土佐’南瓜為砧木，采用嫁接吊蔓栽培，單蔓整枝，第2雌花留單瓜，在大棚內(nèi)按常規(guī)栽培方式進(jìn)行管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取及DNA低pH、高pH池的構(gòu)建 利用改良的CTAB法[13]提取西瓜幼苗基因組DNA，用核酸蛋白檢測儀及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)BC7F1世代果實(shí)酸味pH值鑒定結(jié)果，分別選取10個(gè)果實(shí)低 pH 值（4.71～5.02）和高 pH 值（6.16～6.49）的單株DNA樣品等量進(jìn)行混合，構(gòu)建DNA低pH池和DNA高pH池，用于SSR標(biāo)記分析。

1.2.2 SSR標(biāo)記分析 試驗(yàn)選取的SSR引物[14]，由上海博彩生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 10 μL，包含 0.5 μL 模板 DNA（50 ng·μL-1），正向和反向引物各 0.6 μL（10 μmol·L-1），1 μL 10×buffer，0.2μL dNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1），7 μL 去離子水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 20 s，50～60℃（根據(jù)不同引物確定不同退火溫度）退火20 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物在4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后照相進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)，與供體親本‘PI 271769’帶型一致的記為 A，與輪回親本‘203Z’帶型一致的記為B，兩親本均有的帶型記為H。

1.2.3 西瓜中心果肉pH調(diào)查 果實(shí)成熟收獲后，沿縱軸平均切成兩半取中心瓜瓤進(jìn)行勻漿，采用酸度計(jì)測其pH值；中心瓜瓤用液氮保存，用作果實(shí)有機(jī)酸含量的測定。

1.2.4 有機(jī)酸組分含量的測定 有機(jī)酸組分的提取參照王軒［12］的方法改進(jìn)后進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取5 g試樣（鮮質(zhì)量），加入25 mL去離子水，80℃水浴提取30 min，冷卻，定容至50 mL，過濾，取5 mL依次過Dionex OnGrard II1cc Cartridge固相萃取小柱和0.22 μm孔徑濾膜。濾液上離子色譜測定，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所農(nóng)業(yè)部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)表型數(shù)據(jù)取3次平均值，采用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；利用Graphical GenoTypes（GGT）軟件進(jìn)行世代基因型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本多態(tài)性引物的篩選

選取在西瓜11條染色體上均勻分布的185對(duì)SSR引物對(duì)輪回親本‘203Z’、供體親本‘PI 271769’及F1代進(jìn)行多態(tài)性篩選（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)有97對(duì)引物在兩個(gè)親本材料之間出現(xiàn)多態(tài)性差異，多態(tài)率為52.4%，且多為共顯性標(biāo)記，說明兩個(gè)親本材料之間遺傳基礎(chǔ)差異較大。

圖1 部分SSR標(biāo)記在兩個(gè)親本及F1上的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 西瓜果實(shí)中心部位有機(jī)酸含量分析

在BC7F1世代，對(duì)果實(shí)性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)有果實(shí)酸味的材料，選擇其中的10個(gè)單瓜進(jìn)行有機(jī)酸含量測定（表1）。可以看出，西瓜果實(shí)中心部位的pH值變化范圍為4.70～5.02；有機(jī)酸主要是蘋果酸，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3.708 mg·g-1，變化范圍為 2.591～4.538 mg·g-1；其次是檸檬酸，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.538 mg·g-1，蘋果酸和檸檬酸構(gòu)成了西瓜果實(shí)的主要有機(jī)酸，占絕大比例；此外還有少量的甲酸、乳酸、琥珀酸及富馬酸。果實(shí)酸味株系與輪回親本‘203Z’相比，盡管‘203Z’有較高的檸檬酸含量，但酸味果實(shí)株系有較低的pH值和特別高的蘋果酸含量，推測有供體親本的染色體片段已滲入到BC7F1世代果實(shí)酸味的單株中。

表1 親本及BC7F1世代部分果實(shí)酸味單株有機(jī)酸含量

2.3 BC7F1世代SSR篩選

選擇在親本之間具有多態(tài)性的97對(duì)SSR引物在‘203Z’、‘PI 271769’和通過 BC7F1世代單株構(gòu)建的低pH、高pH池中進(jìn)行篩選，結(jié)果有4對(duì)SSR標(biāo)記（表2）在低pH、高pH池之間出現(xiàn)差異條帶，其中在低pH池中擴(kuò)增出來的為雜合帶型，而在高pH池中擴(kuò)增出來的帶型與輪回親本‘203Z’一致。

表2 在低pH與高pH池之間具有差異條帶的SSR引物序列

圖2 BC7F1世代單株3-10基因型分析

2.4 BC7F1單株基因型分析

選擇BC7F1世代果實(shí)酸味株系中的其中一個(gè)單株3-10進(jìn)行基因型分析（圖2），可以發(fā)現(xiàn)：在西瓜的第6和第10染色體上存在2條不同長度的來源于供體親本‘PI 271769’的外源片段，長度分別為3.65 cM和8.80 cM，且為雜合片段，外源片段總長度為12.45 cM，而構(gòu)建的圖譜總長度為772.8 cM，背景回復(fù)率為98.4%，而理論上BC7世代背景回復(fù)率為99.2%。

2.5 BC7F1世代果實(shí)酸味株系基因型比較分析

通過對(duì)選擇的BC7F1世代10個(gè)果實(shí)酸味株系的基因型進(jìn)行比較（圖3），可以看出：每個(gè)單株存在2～4個(gè)不等的外源野生片段，有6個(gè)以上的不同單株在西瓜的第2、第6和第10染色體上都存在外源野生片段，獲得了由野生西瓜‘PI271769’為供體親本，栽培種西瓜‘203Z’為輪回親本的高代回交導(dǎo)入系群體。

圖3 BC7F1世代10個(gè)果實(shí)酸味株系基因型比較

3 討論

本試驗(yàn)以栽培種西瓜‘203Z’為輪回親本、野生西瓜‘PI 271769’為供體親本，通過離子色譜法，檢測到兩個(gè)親本及BC7F1世代個(gè)體中成熟果實(shí)中心部位的有機(jī)酸主要為蘋果酸，其次是檸檬酸，此結(jié)果與王堅(jiān)［7］、Dune［8］、劉景安［9］的研究結(jié)果相一致。但也有研究認(rèn)為［10-11］，西瓜成熟果實(shí)中的有機(jī)酸主要為蘋果酸和酒石酸，推測造成這種差異的原因可能是試驗(yàn)材料的不同。劉慧英［10］還詳細(xì)研究了不同嫁接西瓜與自根西瓜果實(shí)動(dòng)態(tài)發(fā)育中有機(jī)酸組分的變化規(guī)律，認(rèn)為嫁接西瓜與自根西瓜相比，在發(fā)育后期有機(jī)酸含量降低。本試驗(yàn)中除野生西瓜‘PI 271769’外，均進(jìn)行嫁接栽培，對(duì)‘203Z’和 BC7F1世代個(gè)體有機(jī)酸含量的測定不會(huì)造成影響，所以BC7F1世代個(gè)體和‘203Z’相比，有機(jī)酸含量較高是有意義的。

BC7F1世代的10個(gè)單株其果實(shí)與輪回親本‘203Z’相比，pH值偏低，蘋果酸和檸檬酸含量較高，其他可測性狀基本一致，并且西瓜果實(shí)有機(jī)酸含量呈現(xiàn)連續(xù)變異的特點(diǎn)，屬于典型的數(shù)量性狀，是由多個(gè)基因共同控制有機(jī)酸的合成，因此可以推測BC7F1世代果實(shí)酸味株系中滲入的一個(gè)或多個(gè)外源野生片段存在著控制西瓜果實(shí)有機(jī)酸合成的關(guān)鍵基因。

通過連續(xù)多代回交獲得的導(dǎo)入系群體，其遺傳背景與輪回親本較一致，只含有少量的外源片段，消除了大部分遺傳背景的干擾，是進(jìn)行目標(biāo)基因精細(xì)定位的良好材料。目前已通過構(gòu)建導(dǎo)入系群體對(duì)多個(gè)植物的重要農(nóng)藝性狀基因進(jìn)行了精細(xì)定位和克隆［15-17］。本試驗(yàn)連續(xù)回交7代，獲得了只在有機(jī)酸含量方面有差異的導(dǎo)入系群體，對(duì)有機(jī)酸合成途徑關(guān)鍵基因的精細(xì)定位和克隆提供了良好的試驗(yàn)材料，同時(shí)也為開發(fā)利用野生酸西瓜的優(yōu)異基因提供了良好的種質(zhì)資源。

隨著西瓜全基因組測序的完成［18］和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已構(gòu)建了多張有關(guān)西瓜的高密度遺傳連鎖圖譜［19-21］，對(duì)西瓜重要的復(fù)雜農(nóng)藝性狀的研究具有重要意義。本試驗(yàn)利用分布在西瓜11條染色體上的97對(duì)SSR標(biāo)記構(gòu)建了含有772.8 cM的遺傳連鎖圖譜，沒有完全覆蓋整個(gè)西瓜基因組，同時(shí)在某些標(biāo)記之間遺傳距離較大，可能會(huì)遺漏某些目標(biāo)外源片段。獲得含有供體親本的外源片段距離較大，候選基因太多，還無法確定哪些關(guān)鍵基因與有機(jī)酸的合成途徑有關(guān)，這需要進(jìn)一步縮短外源片段的長度，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精細(xì)定位。

通過對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行重測序，可以開發(fā)新的分子標(biāo)記來增加標(biāo)記的數(shù)量，構(gòu)建高密度的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合已構(gòu)建好的導(dǎo)入系群體，從而實(shí)現(xiàn)西瓜果實(shí)有機(jī)酸合成關(guān)鍵基因的精細(xì)定位和克隆，解析這一復(fù)雜性狀，同時(shí)利用這一具有酸味的西瓜創(chuàng)新種質(zhì)資源，選育具有酸甜風(fēng)味的西瓜新品種，更好地為西瓜生產(chǎn)者和消費(fèi)者提供服務(wù)。