人參皂甙Rg1與坐骨神經損傷后修復相關性研究

馮慧瓊，董峰.內蒙古包頭醫學院第一附屬醫院神經內一科，內蒙古包頭　0400；.內蒙古包頭包鋼集團第三職工醫院骨科，內蒙古包頭　0400

人參皂甙Rg1與坐骨神經損傷后修復相關性研究

馮慧瓊1，董峰2
1.內蒙古包頭醫學院第一附屬醫院神經內一科，內蒙古包頭014010；2.內蒙古包頭包鋼集團第三職工醫院骨科，內蒙古包頭014010

目的 探討中藥人參皂苷Rg1（GsRg1）對大鼠坐骨神經損傷后恢復作用以及是否有局部釋放神經生長因子的參與。方法 于2013年5月購買健康雄性Wistar大鼠，2月齡，共270只，隨機均分為6組，每組45只。離斷大鼠右側坐骨神經后，立即在顯微鏡下縫合，左側坐骨神經為空白對照，手術后，大鼠隨機分為生理鹽水組、GsRg1 2 mg、4 mg、8 mg、12 mg組和甲鈷胺組，分別腹腔內注射，手術2、4、8周后，通過稱量大鼠雙側小腿三頭肌計算其濕重比率，據此評價坐骨神經再生和功能恢復情況；采用免疫組織化學和Western blot技術檢測大鼠坐骨神經NGF表達的變化。結果①小腿三頭肌濕重比，各GsRg1劑量組及甲鈷胺組也明顯高于生理鹽水組，GsRg1組中4 mg組、8 mg組高于GsRg1其它2組及甲鈷胺組，GsRg1 2 mg組、12 mg組與甲鈷胺組小腿三頭肌濕重比恢復相似。②NGF免疫組化及Western blot結果顯示，GsRg1各組及甲鈷胺組NGF表達明顯高于生理鹽水組。GsRg1 4 mg和GsRg1 8 mg組NGF表達多于甲鈷胺組、GsRg1 2 mg組、12 mg組。甲鈷胺組與GsRg1 2 mg組、12 mg組NGF表達相似。結論①GsRg1劑量為4 mg、8 mg的促神經再生和功能恢復作用優于劑量為2 mg、12 mg組。提示GsRg1促神經再生作用的最佳用藥劑量為4～8 mg·kg。②GsRg1的促進受損神經功能恢復的作用與NGF因子密切相關。

人參皂苷Rg1；坐骨神經；神經損傷；神經再生；神經生長因子

［Abstract］Objective To observe whether the Rg1 can promote nerve function recovery after sciatic nerve injury and to investigate whether the partial release nerve growth factor participate in its mechanism,on the basis of which we can make a further study of its mechanism.Methods We use male Wistar rats for making a sciatic nerve injury model.february age,a total of 270,were randomly divided into 6 group,each group of 45.Under anesthesia,we amputate the right sciatic nerve of the rats and then stitch it up immediately under the surgical microscope,taking the left sided sciatic nerve as the blank control.After the surgery,They are saline group,GsRg1 2 mg group,Gs 4 mg group,Gs 8 mg group,Gs 12 mg group and Mecobalamin group.After 2 weeks,4 weeks and 8 weeks of surgery,we can weigh the Rat two-side triceps surae muscle measuring its wet weight ratio,we can evaluate the regeneration and functional recovery of the sciatic nerve；and detect the changes of NGF expression of sciatic nerve in rats with Immunohistochemistry and Western blot technology.Results①Triceps surae muscle wet weight ratio,each dose group of GsRg1 and Mecobalamin group is also significantly higher than Saline group,in GsRg1 group,4 mg group and 8 mg group are all higher than the other two groups of GsRg1,the recovery of GsRg1 2 mg group and 12 mg group are similar to nerve conduction velocity of Mecobalamin group and Triceps surae muscle wet weight ratio.②NGF Immunohistochemistry and Western blot results indicate that the NGF expression of GsRg1 groups and Mecobalamin group are higher than Saline group.The NGF expression of GsRg1 4 mg and GsRg1 8mg were more than Mecobalamin group,GsRg1 2 mg group and GsRg1 12 mg group.The NGF expression of Mecobalamin group is similar to GsRg1 2 mg group and GsRg1 12 mg group.Conclusion①GsRg1 could promote rat sciatic nerve transaction injury and enhance the nerve regeneration and functional recovery after surgical sutures；It suggests that the best dosage of GsRg1 for promoting nerve functional regeneration is 4～8 mg·kg.②The function of GsRg1 for promoting the recovery of injured nerve is related to NGF factor.

［Key words］Ginsenoside Rg1；Sciatic nerve；Nerve injury；Nerve rehabilitation；Nerve growth factor

人參是我國名貴的補益強壯養生佳品，李君慶等［1］人通過對人參皂甙Rg1抗神經細胞凋亡作用機制的研究發現人參皂甙Rg1抗神經元凋亡是通過抑制DNA的斷裂發揮的作用。曾經有文獻報道，Schwann細胞能夠促進周圍神經的損傷修復，同時研究表明研究表明，人參皂甙單體Rg1可促進Schwann細胞的分裂增殖及遷移［2］。張志軍等［3］人等研究表明人參皂甙單體Rg1促進周圍神經的損傷修復是通過影響內皮細胞的血管擴張及直接作用而完成的。上述資料進一步支持人參皂甙單體Rg1可促進周圍神經的再生。該研究進一步明確人參皂苷Rg1是否能夠促進離斷后縫合的坐骨神經功能恢復；Rg1是通過什么途徑促進已經離斷的神經纖維修復再生；其發揮作用的機制中是否有NGF因子的參與，因此該研究對270只購買于2015年5月的健康雄性Wistar大鼠進行研究，明確 GsRg1能否進一步促進NGF蛋白的表達，從而促進損傷后的周圍神經功能修復這一假設出發，利用已經成熟的坐骨神經離斷后縫合技術制備大鼠損傷模型，進一步進行形態和功能上的研究，具體報道如下。

1　實驗動物及方法

1.1實驗動物分組及模型建立

健康雄性Wistar大鼠，2月齡，共270只，體重（275± 25）g,所有動物及飼料均購買自內蒙古大學動物實驗中心，實驗動物的許可證號為：SCXK（蒙）2002-0001，購回的大鼠先進行適應性飼養5～7 d，實驗過程中對動物的操作方法均符合實驗動物操作規定，符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。每只行右側坐骨神經離斷后纖維吻合，隨機均分為6組，每組45只。4個實驗組分別以2.0、4.0、8.0 mg/（kg·d）和12.0 mg/（kg·d）腹腔注射人參皂苷Rg1，陽性對照組腹腔注射100 mg/（kg·d）甲鈷胺（Mecobalamin），陰性對照組注射生理鹽水，均連續給藥8周。每只大鼠右側為損傷側，左側為正常對照。配置相關試驗溶液。大鼠坐骨神經損傷模型的建立：成年雄性Wistar大鼠，用10%的水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg），達到麻醉要求后，俯臥位固定大鼠、脫毛、消毒手術視野，在無菌條件下于右下肢股后部做一縱切口，長約1.5 cm，手術顯微鏡下無菌分離大腿的各肌層，充分顯露并游離坐骨神經，后在梨狀肌下緣0.8 cm處將坐骨神經離斷，隨即用無菌11-0無創傷尼龍線縫合，神經外膜處縫合4針，顯微縫線留置于該損傷區外膜上作為標記，然后用無菌1-0線逐層關閉切口。所有操作均由一人完成。術后觀察動物清醒后，分籠飼養，勤換墊料以防止足底潰瘍發生。

1.2實驗藥物

人參皂甙Rg1由吉林大學生化教研室提供。甲鈷胺（批準文號：國藥準字H20050352，規格：0.5 m）g。1.3檢測指標及方法

1.3.1小腿三頭肌濕重（WWT）術后2、4及8周神經電生理檢測后，完整取出大鼠雙側小腿三頭肌并用分析天平稱量，三頭肌濕重恢復率＝（損傷側WWT÷正常側WWT）×%。

1.3.2坐骨神經遠端組織進行NGF免疫組化檢測術后2周時分別取吻合口遠端及對側坐骨神經給予固定、脫水、切片后，按照免疫組化試劑盒中的說明書中的方法法檢測NGF蛋白，攝取圖像，用圖像分析軟件對其結果進行處理。

1.3.3坐骨神經中NGF含量進行Western blot檢測

①神經組織取材及蛋白提取：術后第2周無菌條件下切取遠端坐骨神經10 mm后，裂解后離心制備蛋白樣品并放入-80℃的冰柜中保存備用。

②蛋白含量測定：待測管蛋白含量＝待測管吸光度值/標準管吸光度值×10 mg/mL

③Western blot的具體實驗步驟：先將分離膠及濃縮膠制備完成，待電泳槽安裝完畢，取150 μg待測蛋白樣品上樣，于4℃環境下進行電泳，當溴酚藍指示劑遷移到膠底約1 cm處停止電泳。隨后進行膠塊的漂洗；轉膜；用5%脫脂奶粉封閉1h；封閉好的膜按照100μL/mm2的濃度，加入1：80的兔抗大鼠NGF一抗，對照組用1% PBS代替，后于4℃密封小袋內靜置過夜；漂洗后進行免疫顯影；對顯色條帶進行半定量分析。

1.4統計方法

將完整的臨床資料和實驗數據均輸入計算機，運用SPSS 17.0統計學軟件進行處理，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1小腿三頭肌濕重恢復率（TSW）

分別于第2、4、8周神經電生理檢測完畢后完，取出6組大鼠雙側小腿三頭肌，于1/萬分析天平（ESJ120-4型）稱其重量，然后安裝。三頭肌濕重恢復率=（損傷側WWT）÷正常側WWT）×%計算出恢復率，結果見表1。

表1　各組小腿三頭肌濕重恢復率不同時間的結果（±s）

表1　各組小腿三頭肌濕重恢復率不同時間的結果（±s）

組別2周4周　8周鹽水組（n=45）甲鈷胺組（n=45）Gs2 mg組（n=45）Gs4 mg組（n=45）Gs8 mg組（n=45）Gs12 mg組（n=45）43.56±3.12 51.23±4.30 48.45±5.25 63.12±4.23 60.83±6.13 49.33±3.34 58.43±4.20 67.45±5.44 69.52±3.23 84.62±5.12 87.34±4.23 67.55±6.02 72.30±4.43 81.57±6.12 80.45±3.34 94.32±4.56 92.15±7.20 83.02±5.13

甲鈷胺組及人參皂甙各組三頭肌濕重恢復率在統計學上顯著高于對照組（P＜0.01）。其中4 mg組及8 mg組顯高于其他4組（P＜0.01）。4 mg組、8 mg組進行組間比較差異無統計學意義，甲鈷胺組、2 mg組及12 mg組行組間相互比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2坐骨神經遠端組織進行NGF免疫組化檢測

各組進行NGF免疫組化檢測（表2），可見2周時NGF陽性細胞在甲鈷胺組和GsRg1中2 mg組，4 mg組，8 mg組，12 mg組比較多，與生理鹽水組相比差異有統計學意義 （P＜0.01），NGF陽性細胞數在這5個組之間比較時發現GsRg1 4 mg組，8 mg組要明顯多于甲鈷胺組及GsRg1 4 mg組，8 mg組（GsRg1 4 mg組，8 mg 組P＜0.05）。

2.3坐骨神經中NGF含量進行Western blot檢測

2周時進行各組的NGFWestern blot分析各組NGF因子表達含量的變化，結果見表2。可見在甲鈷胺組和GsRg1組4 mg、8 mg組中，NGF表達含量較高，與其它3組相比差異有統計學意義。而在這3組內部比較，GsRg1組4 mg和8 mg組含量要高于甲鈷胺組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。而在生理鹽水組與GsRg1組2 mg、12 mg各組之間差異無統計學意義。

表2　各實驗組2周時進行NGF免疫組化及Western blot結果（±s）

表2　各實驗組2周時進行NGF免疫組化及Western blot結果（±s）

注：▲與生理鹽水組和GsRg1組2 mg、12 mg組比較P＜0.01；■與甲鈷胺組比較，P＜0.05。

Groups（例數）　陽性細胞數所占比例%NGF蛋白表達的相對水平（μg/mLl）生理鹽水組（45）甲鈷胺組（45）GsRg1組2 mg（45）GsRg1組4 mg（45）GsRg1組8 mg（45）GsRg1組12 mg（45）15.64±8.33 （45.17±6.71）▲35.63±8.27 （55.22±6.24）▲■（58.34±3.10）▲■39.41±6.19 0.24±0.07 （0.63±0.12）▲0.26±0.02 （0.87±0.04）▲■（0.98±0.21）▲■0.33±0.04

3　討論

人參皂甙Rg1是其中最為重要的單體之一，藥理學作用相當廣泛，尤其是人參皂甙Rg1的神經保護和營養作用更是受到關注。該研究結合臨床及基礎的最新研究，從周圍神經損傷的治療方面，以動物實驗研究為主，對于大鼠的人參皂苷Rg1的劑量選擇，我們參考其它國內的實驗［4］，分別選擇2、4、8、12 mg的劑量，便于藥理學的分析，通過比較實驗組三頭肌濕重恢復率在統計學上顯著高于對照組（P＜0.01）。其中4 mg組及8 mg組顯著高于其他4組（P＜0.01）。4 mg組、8 mg組進行組間比較差異無統計學意義，甲鈷胺組、2 mg組及12mg組行組間相互比較差異無統計學意義（P＞0.05）。各組進行NGF免疫組化檢測，可見2周時NGF陽性細胞在甲鈷胺組和GsRg1中4 mg組，8 mg組比較多，與其它3組相比差異有統計學意義，NGF陽性細胞數在這3個組之間比較時發現GsRg1組要明顯多于甲鈷胺組（P＜0.05），但在GsRg1組4 mg與8 mg兩組間沒有明顯統計學差異。而在GsRg1劑量為2 mg、12 mg組和生理鹽水組中陽性細胞數較少，但這3個組間比較NGF陽性細胞可見GsRg1組要多于生理鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.05）。2周時進行各組的NGF Western blot分析各組NGF因子表達含量的變化。可見在甲鈷胺組和GsRg1組4 mg、8 mg組中，NGF表達含量較高，與其它3組相比差異有統計學意義。而在這3組內部比較，GsRg1 4 mg和8 mg組含量要高于甲鈷胺組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而在生理鹽水組與GsRg1 2 mg、12 mg組之間差異無統計學意義。綜上所述，濃度為4～8 mg的人參皂苷Rg1作用最為明顯，顯示這一范圍的人參皂苷可以發揮比較好的促進神經功能恢復的作用。這一結果與國內周鵬等［5］人的結果相似，2 mg與12 mg組的GsRg1作用的效果較差一些，作用不如其它明顯，其中4～8 mg組與臨床常用的甲鈷胺相比，其作用相當甚至優于甲鈷胺，提示人參皂苷Rg1確實有促進周圍神經功能恢復的特性，能夠成為更好的促進周圍神經生長的藥物。但其具體參與調控的機制有待進一步的研究來揭示。根據研究報道［6-7］得知神經生長因子可以引發包括蛋白激酶C在內的信號轉導，從而促進離子通道及結構原件的表達，這些離子通道及結構元件正是神經元分化和延長所必須的。由此可見NGF可以促進神經細胞突起的生長，對于周圍神經離斷后再縫合，細胞突起的生長也需要相應的營養物質的支持。國內文獻報道證實［7］人參皂甙在神經神經因子缺少的培養液中可以促進PC12的軸突生長，同時對加入MPTP或SNK-SH細胞的培養液中具有營養和保護神經細胞的作用。同時研究證實人參皂甙可以增加海馬區神經生長因子的mRNA的表達以及基底節區的膽堿乙酰基轉移酶的mRNA的表達。在該研究中可見GsRg1組中神經組織中有NGF表達增多，其中以4 mg和8 mg組作用最強，其作用優于傳統臨床應用的甲鈷胺的促神經功能恢復的作用，結合NGF的免疫組化與Western blot分析，顯示這一作用與周圍神經釋放更多的神經生長因子有關，與國內其它研究學者的觀點相近［8-13］。GsRg1治療組促進神經功能康復效果優秀，期待后期更多的研究應用于臨床的周圍神經損傷疾病中。

結合該研究，隨著生物學技術的發展及藥理學的發展，對于人參皂苷對周圍神經的營養作用也會逐漸增多，促進周圍神經生長、神經功能恢復的藥物的探索的報道也會越來越多。這也將會是下一步的研究方向。該課題創新性為在前期研究的基礎上，采用大鼠坐骨神經建立動物實驗模型，首次在體內系統地研究周圍神經離斷損傷并吻合術后，人參皂甙單體Rg1促進損傷神經再生和功能恢復的作用及其劑量效應關系、最佳有效治療劑量和毒性劑量；同時探究其對損傷神經相關神經元存活、死亡和相關生物分子的影響，以及對Schwann細胞凋亡、增值和分泌功能的作用，進而闡明其作用機理。

4　結語

①GsRg1劑量為4 mg、8 mg的促神經再生和功能恢復作用優于劑量為2 mg、12 mg提示GsRg1促神經再生作用的最佳用藥劑量為4～8 mg。②GsRg1的促進受損神經功能恢復的作用于NGF因子密切相關。

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The Experimental Study on Mechanism underlying the Promoted Regeneration of Injured Sciatic Nerve by Ginsenoside Rg1

FENG Hui-qiong1，DONG Feng2
1.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital,Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia,014010 China；2.Department of orthopaedics,Inner Mongolia baotou steel group,the third worker hospital,Baotou,Inner Mongolia,014010 China

R651.3

A

1674-0742（2016）08（a）－0001-05

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.22.001

馮慧瓊（1985.10-），女，內蒙古包頭人，碩士，主治

醫師，研究方向：神經病學。

2016-05-09）