黃芪甲苷促M2型巨噬細胞極化的作用研究

戴良成，袁保紅，羅曉春，黃萍，尹輝（.廣東藥科大學附屬第一醫院重癥醫學科，廣東 廣州50080；.廣東藥科大學 基礎學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州50006）

黃芪甲苷促M2型巨噬細胞極化的作用研究

戴良成1，袁保紅2，羅曉春2，黃萍2，尹輝2
（1.廣東藥科大學附屬第一醫院重癥醫學科，廣東 廣州510080；2.廣東藥科大學 基礎學院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006）

目的探討黃芪甲苷對M2型巨噬細胞極化的影響。方法黃芪甲苷體外作用小鼠原代巨噬細胞，用流式細胞儀檢測其表面分子（CD206、MHCII和CD80/86）表達，Real time-PCR檢測M1/M2型巨噬細胞特征基因（iNOS、YM1和Arg1）的表達，ELISA測定炎癥相關細胞因子（TNF-α、IL-6、TGF-β）的表達。結果黃芪甲苷單獨處理未能誘導M2型巨噬細胞生成，但其與IL-13聯合處理可明顯上調M2型巨噬細胞標志CD206、YM1和Arg1的表達，下調抗原提呈相關分子MHCII和CD80/86的表達，促進抑炎細胞因子TGF-β的分泌。結論黃芪甲苷通過協同作用方式促進M2型巨噬細胞極化。

黃芪甲苷；巨噬細胞；M1/M2型極化；TGF-β

巨噬細胞是造血系統中可塑性最強的一類細胞，具有極強的功能多樣性，在機體正常發育、體內平衡、組織修復和抗病原體感染中發揮重要作用［1-3］。根據表型和功能差異，巨噬細胞分M1型即經典活化的巨噬細胞和M2型即替代性活化的巨噬細胞。M1型巨噬細胞參與促炎反應，在防御病原體感染中發揮核心作用；M2型巨噬細胞與抗炎反應、組織重構及腫瘤疾病發展相關［4-5］。黃芪甲苷

（astragaloside IV，AS-IV）作為黃芪主要活性成分，在調節機體免疫應答、促損傷組織修復中起重要作用，然而其促組織巨噬細胞M2型極化的影響尚不清楚［6-7］。本文從黃芪甲苷對巨噬細胞M1/M2型分化、特征及功能影響進行研究，為明確黃芪甲苷在組織修復重塑中的免疫機理奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質量20～25 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號SCXK（粵）2008-0002。

1.1.2試劑 AS-IV（純度≥98%，阿拉丁公司）；TRIzol試劑、SYBR Green qPCR kit（美國Invitrogen公司）；ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）；熒光素標記CD206、MHCII和CD80/86單克隆抗體（美國Biolegend公司）。

1.1.3主要儀器 相差倒置顯微鏡CKX41SF（日本Olymbus公司）；酶標儀Model 680（美國BIO-RAD公司）；PCR儀T3000（美國Biometra公司）；流式細胞儀FACS CALIBUR（美國BD公司）。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓來源原代巨噬細胞培養［8］分離C57BL/6小鼠股骨，用DMEM沖洗骨髓腔獲得單個骨髓細胞；篩網過濾，離心棄上清，裂解紅細胞；DMEM（含10%FBS）洗滌1次并重懸細胞，接種至培養皿，37℃、5%（φ）CO2進行培養；4 h后，收集未貼壁細胞，用含巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）培養基重懸，繼續培養至7 d，即可獲得成熟的原代巨噬細胞。

1.2.2巨噬細胞極化實驗 調整巨噬細胞密度為1 ×106/mL，并鋪于12孔細胞培養板（1 mL/孔）中，培養過夜。分5組誘導巨噬細胞極化，包括PBS對照組、100 ng/mL脂多糖（LPS）處理組、20 ng/mL IL-13處理組、30 μg/mL黃芪甲苷（AS-IV）處理組、20 ng/mL IL-13聯合30 μg/mL黃芪甲苷處理組。37℃培養24 h或48 h后，收集巨噬細胞和培養上清，進行相關指標檢測。

1.2.3流式細胞儀測定巨噬細胞的表面標志 重懸巨噬細胞，加入不同熒光標記的anti-CD80 mAb、anti-CD86 mAb、anti-MHCII mAb和anti-CD206 mAb，室溫孵育30 min；流式細胞儀CALIBUR檢測細胞表面標志。

1.2.4Real-time PCR檢測基因表達 TRIzol提取巨噬細胞總RNA，逆轉錄生成cDNA，SYBR Green qPCR檢測iNOS、YM1和Arg1基因的表達水平。運用2-ΔΔCt法計算各組基因相對表達量。引物序列見表1。

1.2.5ELISA測定細胞因子表達 收集巨噬細胞培養上清，按照ELISA kit操作步驟，測定TNF-α、IL-6 和TGF-β水平。

1.2.6統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，實驗數據用s表示，兩組間變量差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1巨噬細胞M1/M2型極化后形態學變化

小鼠骨髓巨噬細胞誘導培養后，LPS、IL-13和AS-IV處理48 h，巨噬細胞形態變化見圖1。LPS誘導巨噬細胞向經典M1型極化，細胞形態呈樹枝狀，有明顯絲狀偽足突起；IL-13誘導巨噬細胞向M2型極化，細胞形態類似未極化的巨噬細胞，成橢圓形或紡錘狀。AS-IV單獨或協同IL-13處理巨噬細胞后，細胞形態呈M2型極化。

2.2AS-IV對M2型巨噬細胞特征性標志CD206表達的作用

AS-IV處理48 h后，流式細胞儀檢測巨噬細胞表面標志的變化情況見圖2。LPS刺激能增強M1型巨噬細胞表達抗原提呈分子（MHCⅡ）和共刺激分子（CD80和CD86）的水平；而IL-13、AS-IV處理后上調M2型巨噬細胞表面CD206的表達，兩者協同作用更為明顯。

表1　PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2.3 AS-IV對M2型巨噬細胞相關基因表達的影響

AS-IV處理24 h后，Real time-PCR檢測M1/M2型巨噬細胞相關基因的變化情況見圖3。LPS刺激能上調M1型巨噬細胞iNOS基因的表達；而AS-IV協同IL-13作用時，能明顯上調M2型巨噬細胞YM1和Arginase-1基因表達，AS-IV單獨處理未能影響相關基因的表達。

2.4AS-IV對M2型巨噬細胞TGF-β表達的影響

AS-IV處理48 h后，收集巨噬細胞培養上清，ELISA測定上清液中細胞因子含量結果見圖4。LPS刺激能上調M1型巨噬細胞炎性細胞因子IL-6和TNF-α表達；IL-13、AS-IV能上調M2型巨噬細胞相關因子TGF-β的表達，兩者協同效應尤為明顯。

圖1　巨噬細胞極化后的形態學觀察Figure 1 Morphology of macrophages after polarization（400×）

圖2　巨噬細胞極化后表面標志的表達水平Figure 2 Expression of surface markers of macrophages after polarization

圖3　巨噬細胞極化后的基因表達水平Figure 3 Gene expression of macrophages after polarization

圖4　巨噬細胞極化后細胞因子表達水平Figure 4 　Levels of cytokines produced by macrophages after polarization

3　討論

黃芪是我國傳統的補益類中藥，具有健脾補中、補氣固表、升陽舉陷、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效［9-10］。AS-IV作為黃芪主要活性成分之一，具有增強機體免疫力、降低血糖、誘導腫瘤細胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的藥理作用，但目前有關AS-IV調節組織創面愈合的免疫機理尚不清楚［11-12］。

巨噬細胞作為一種具有高度可塑性和多能性的細胞群體，在體內復雜的微環境中，表現出獨特的表型和功能。根據活化狀態和功能差異，巨噬細胞分為M1型和M2型。M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原信號，參與正向免疫應答，發揮免疫監視的功能；M2型巨噬細胞僅有較弱的抗原提呈能力，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10和/或TGF-β等下調免疫應答，在免疫調節中發揮重要作用［4-5］。本實驗結果顯示:AS-IV協同IL-13處理，能明顯上調M2型巨噬細胞特征性標志CD206、YM1和Arg1表達；下調MHCII和CD80/ 86表達，降低巨噬細胞的抗原提呈能力，并促進抑制性細胞因子TGF-β的分泌。TGF-β作為一種轉化生長因子，可促進傷口修復過程中相關細胞和因子的產生，如促進成纖維細胞的增殖、細胞外基質的合成和促進角化細胞遷移從而縮小創面面積并加快愈合速度，還可誘導調節性T細胞的生成，抑制輔助性T細胞的活化，緩解炎癥反應對組織的損傷作用［13］。

Peng等［14］報道AS-IV通過調節成纖維細胞的增殖，促進正常皮膚組織傷口修復。AS-IV可促進糖尿病小鼠組織創面愈合，與上調促M2型巨噬細胞極化關鍵細胞因子IL-13的表達相關，但其機理有待明確［15］。本研究發現相對AS-IV單獨處理，其協同IL-13更能有效誘導巨噬細胞向M2型極化，并表現相應的功能活性。因此，在探討AS-IV調節損傷組織修復的免疫機理時，應考慮體內微環境對組織巨噬細胞極化的潛在影響。

［1］FRANKEN L，SCHIWON M，KURTS C.Macrophages: sentinels and regulators of the immune system［J］.Cell Microbiol，2016，18（4）:475-487.

［2］BOUTENS L，STIENSTRA R.Adipose tissue macrophages: going off track during obesity［J］.Diabetologia，2016，59 （5）:879-894.

［3］WYNN T A，VANNELLA K M.Macrophages in tissue repair，regeneration，and fibrosis［J］.Immunity，2016，44 （3）:450-462.

［4］VAN DYKEN S J，LOCKSLEY R M.Interleukin-4-and interleukin-13-mediated alternatively activated macrophages: roles in homeostasis and disease［J］.Annu Rev Immunol，2013，31:317-343.

［5］MILLS C D.M1 and M2 macrophages:oracles of health and disease［J］.Crit Rev Immunol，2012，32（6）:463-488.

［6］XU Hao，WANG Changyao，ZHANG Haining，et al.Astragaloside IV suppresses inflammatory mediator production in synoviocytes and collageninduced arthritic rats［J］.Mol Med Rep，2016，13（4）:3289-3296.

［7］SHAN Yinghui，PENG Lihua，LIU Xin，et al.Silk fibroin/ gelatin electrospun nanofibrous dressing functionalized with astragaloside IV induces healing and anti-scar effects on burn wound［J］.Int J Pharm，2015，479（2）:291-301.

［8］TROUPLIN V，BOUCHERIT N，GORVEL L，et al.Bone marrow-derived macrophage production［J］.J Vis Exp，2013，81:e50966.

［9］FU Xiao，SONG Bing，TIAN Guowei，et al.The effects of the water-extraction of Astragali Radix and Lycopi herba on the pathway of TGF-smads-UPP in a rat model of diabetic nephropathy［J］.Pharmacogn Mag，2014，10（40）:491-496.

［10］JIN Yecheng，CHEN Qian，LI Xiang，et al.Astragali Radix protects myocardium from ischemia injury by modulating energy metabolism ［J］.Int J Cardiol，2014，176（3）: 1312-1315.

［11］CHEN Jianguo，CHEN Yifang，LUO Yunling，et al. AstragalosideIVamelioratesdiabeticnephropathy involving protection of podocytes in streptozotocin induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2014，736:86-94.

［12］CHENG Xudong，GU Junfei，ZHANG Minghua，et al. Astragaloside IV inhibits migration and invasion in human lung cancer A549 cells via regulating PKC-α-ERK1/2-NF-κB pathway［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（1）: 304-313.

［13］MENG Xiaoming，NIKOLIC-PATERSON D J，LAN Huiyao. TGF-β:the master regulator of fibrosis［J］.Nat Rev Nephrol，2016，12（6）:325-338.

［14］PENG Lihua，CHEN Xi，CHEN Lei，et al.Topical astragaloside IV-releasing hydrogel improves healing of skin wounds in vivo［J］.Biol Pharm Bull，2012，35（6）: 881-888.

［15］LUO Xiaochun，HUANG Ping，YUAN Baohong，et al. AstragalosideIVenhancesdiabeticwoundhealing involving upregulation of alternatively activated macrophages ［J］.Int Immunopharmacol，2016，35:22-28.

（責任編輯：幸建華）

Effect of astragalus IV on M2 macrophage polarization in vitro

DAI Liangcheng1，YUAN Baohong2，LUO Xiaochun2，HUANG Ping2，YIN Hui2
（1.Intensive Care Unit，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China；2.Guangdong Province Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the effect of astragalus IV on M2 macrophage polarization in vitro.Methods Primary macrophages were isolated from mice，and treated with astragalus IV.The surface markers of CD206，MHCII and CD80/86 were analyzed by flow cytometry.M1/M2-associated genes iNOS，YM1 and Arginase-1 were detected by real time-PCR.Levels of IL-6，TNF-α and TGF-β were measured by ELISA. Results Astragalus IV combined with IL-13 significantly increased the expression of M2-associated markers CD206，YM1 and Arginase-1，decreased MHCII and CD80/86 expression and upregulated the level of TGF-β in macrophages.Conclusion Astragalus IV contributes to M2 macrophage polarization in vitro in a synergistic manner.

astragalus IV；macrophages；M1/M2 type polarization；TGF-β

R285

A

1006-8783（2016）04-0494-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016052501

2016-05-25

廣東省自然科學基金項目（2014A030313581，2015A030313581）；廣東藥學院科技處—附屬第一醫院聯合自然科學培育基金項目（GYFYLH201320）

戴良成（1968—），男，副主任醫師，主要從事ICU重癥醫學研究，Email:13798101830@163.com；通信作者:尹輝（1975—），教授，主要從事炎癥相關免疫性疾病研究，Email:huiyin0103@163.com。

網絡出版時間:2016-07-04 15:19 網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160704.1519.002.html